耳聾基因診斷及其在遺傳性耳聾預(yù)防和阻斷中的應(yīng)用研究

孫莉莉 張麗 柳愛(ài)華

（沈陽(yáng)市婦女兒童保健中心，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

耳聾是影響人類(lèi)健康和造成人類(lèi)殘疾的常見(jiàn)疾病。據(jù)我國(guó)2006年第二次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查顯示，聽(tīng)力殘疾者2 780萬(wàn)，占全國(guó)8 296萬(wàn)殘疾人的31%，占世界聽(tīng)障人群的25%。其中0～6歲聽(tīng)障兒童80萬(wàn)，6～14歲聽(tīng)障兒童11萬(wàn)，每年新生聾兒＞3萬(wàn)（不包括遲發(fā)性聾以及藥物性聾）［1］。歐美國(guó)家統(tǒng)計(jì)表明1／2 000（0.05%）～1／1 000（0.1%）的新生兒中會(huì)有1名重度或極重度聽(tīng)力喪失患兒，其中一半以上屬于遺傳性耳聾［2-4］。在我國(guó)60%的耳聾是由于遺傳的因素造成的，40%是環(huán)境因素導(dǎo)致的［5］。

1 耳聾基因的概況

到目前為止，已有數(shù)百種耳聾綜合征見(jiàn)于報(bào)道，但只有約30%的遺傳性耳聾病例屬于遺傳性綜合征性耳聾，絕大部分的遺傳性耳聾被定義為非綜合征性耳聾。遺傳性非綜合征性耳聾按遺傳模式又被分為：①77%的病例為常染色體隱性；②22%的病例為常染色體顯性；③1%的病例為x連鎖；④小于1%的病例為線粒體遺傳［4］。自1986年以來(lái)，遺傳性耳聾的病因?qū)W研究有了很大進(jìn)展，已有60余個(gè)耳聾基因被克?。?］。到2010年為止，美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳聾突變基因數(shù)據(jù)庫(kù)中保存著已發(fā)現(xiàn)的耳聾致病基因其中與常染色體隱性遺傳有關(guān)的基因有GJB2、GJB3、SLC26A4、MYO6等41種；與常染色體顯性遺傳有關(guān)的基因除了GJB2、GJB3以外還有EYA4、COCH等25種；與X連鎖有關(guān)的基因?yàn)镻RPS1、POU3F4 2種；與線粒體有關(guān)的突變基因?yàn)镸TRNR1、MTTS1等6種還有大片段的缺失及復(fù)制［6］。

同時(shí)在美國(guó)和歐洲的遺傳性耳聾人群中，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)耳聾重點(diǎn)基因，如由GJB2基因突變導(dǎo)致的耳聾占常染色體隱性遺傳非綜合征耳聾50%以及PDS基因突變導(dǎo)致Pendred綜合征，此2項(xiàng)基因檢測(cè)已被美國(guó)哈佛大學(xué)兒童醫(yī)院以及愛(ài)荷華大學(xué)醫(yī)學(xué)中心列為常規(guī)臨床檢測(cè)項(xiàng)目［7］。雖然耳聾具有很高的遺傳異質(zhì)性，加大了遺傳性耳聾分子診斷的難度，但我國(guó)大范圍的流行病學(xué)調(diào)查顯示，GJB2、SLC26A4（PDS）和線粒體基因（mtDNA）的病理性突變導(dǎo)致遺傳性耳聾占大部分［8，9］，這就為新的耳聾預(yù)防策略帶來(lái)希望。

1.1 GJB2基因相關(guān)耳聾 GJB2編碼連接蛋白（Connexin26），負(fù)責(zé)細(xì)胞間信號(hào)介導(dǎo)和離子傳遞，突變的GLB2可能導(dǎo)致產(chǎn)生不正常的連接蛋白，進(jìn)而干擾細(xì)胞間隙連接的功能，引起內(nèi)耳鉀離子回收障礙而致聾。Connexin 26對(duì)維護(hù)耳蝸的正常功能非常重要。研究表明GJB2突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾遍布美國(guó)、歐洲各國(guó)以及突尼斯、黎巴嫩、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家。在人種間，存在不同的GJB2基因突變及發(fā)生頻率，到目前為止已發(fā)現(xiàn)GJB2基因110余種突變方式［6］。目前來(lái)自中國(guó)和日本的資料揭示GJB2基因突變?cè)趤喼奕诉z傳性耳聾中的也有一定的發(fā)生比例。在中國(guó)人中，兒童語(yǔ)前聾的26%～33%為GJB2基因突變所致，占常染色體隱性遺傳性聾的28%，其突變的主要方式為233-235delC，檢出率為13.64%～21.5%［10-13］。臨床特點(diǎn)：主要表現(xiàn)為雙耳重度或極重度感音神經(jīng)性耳聾，絕大多數(shù)患者均表現(xiàn)為先天性、對(duì)稱(chēng)性以及非進(jìn)行性耳聾。

1.2 線粒體耳聾基因 線粒體DNA突變與遺傳性耳聾有密切關(guān)系。1993年P(guān)rezant等發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致人類(lèi)氨基糖甙類(lèi)藥物引起的非綜合征型耳聾的分子病理基礎(chǔ)為線粒體DNA 12SrRNA A1555G點(diǎn)突變，據(jù)分析此突變通過(guò)改變線粒體DNA的空間結(jié)構(gòu)使形成新的與氨基糖甙類(lèi)抗生素結(jié)合位點(diǎn)而導(dǎo)致對(duì)此類(lèi)藥物敏感而致聾。1996年起袁慧軍研究員首先在國(guó)內(nèi)開(kāi)展了藥物敏感個(gè)體耳聾致病機(jī)制的研究，在國(guó)內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了母系遺傳藥物性耳聾家系中12SrRNA的A1555G突變最為常見(jiàn)，確定此突變是導(dǎo)致藥物敏感性的最根本原因，突變引起線粒體基因結(jié)構(gòu)變異，使氨基糖甙類(lèi)抗生素攻擊內(nèi)耳組織，導(dǎo)致一針致聾。線粒體遺傳屬于母系遺傳的特點(diǎn)成為預(yù)防m(xù)tDNAA1555G突變攜帶者發(fā)生藥物性耳聾的關(guān)鍵。平均發(fā)現(xiàn)一個(gè)攜帶者可以為10個(gè)以上的未發(fā)病的母系成員提供預(yù)警和用藥指導(dǎo)。通過(guò)進(jìn)行線粒體基因突變篩查，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)敏感個(gè)體，對(duì)其未發(fā)病的母系家庭成員進(jìn)行預(yù)防宣教［14，15］。據(jù)調(diào)查顯示，mtDNAA1555G在中國(guó)耳聾人群的攜帶頻率為3.8%，mtDNAC1494T的攜帶率為0.6%［5］。

1.3 SLC26A4基因 近年來(lái)國(guó)外的多項(xiàng)研究表明，大前庭水管綜合征和Pendred綜合征（前庭水管擴(kuò)大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫）與SLC26A4基因突變有密切的關(guān)系。SLC26A4基因又稱(chēng)PDS基因，位于人類(lèi)染色體7q31，含有21個(gè)外顯子，編碼含有780個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族。研究表明Pendrin功能與氯／碘離子、氯／甲酸根、氯／碳酸氫根離子和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［16，17］。由中國(guó)大前庭水管患者群的SLC26A4（PDS）基因分析表明，在95%～97%中國(guó)人大前庭水管患者中可以發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)SLC26A4（PDS）基因突變，并且大多數(shù)患者可以發(fā)現(xiàn)純合或復(fù)合突變，顯示中國(guó)人大前庭水管綜合征是肯定的遺傳性疾病，其發(fā)病原因是SLC26A4（PDS）基因突變，其中PDS基因IVS7-2A-G突變是中國(guó)人大前庭水管綜合征中的高發(fā)突變，占突變總數(shù)的63.5%。約在80%的大前庭水管患者中可發(fā)現(xiàn)此突變，1%的正常人攜帶此種雜合突變［18］。臨床特點(diǎn)是雙側(cè)感音神經(jīng)性耳聾，CT或MRI提示前庭水管或內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大，一部分患者出生時(shí)可能聽(tīng)力正常，聽(tīng)力下降程度在不同的個(gè)體具有較大的差別，從聽(tīng)力完全正常至中重度聽(tīng)力損傷，因墮床、兒童玩?；蝮w育活動(dòng)中的輕度碰撞或感冒可以造成明顯聽(tīng)力下降，亦存在無(wú)明顯誘因而發(fā)生聽(tīng)力下降的情況。

2 耳聾基因的診斷方法

2.1 酶切方法 限制性核酸內(nèi)切酶是一類(lèi)具有嚴(yán)格識(shí)別位點(diǎn)的酶類(lèi)，它可以特異地識(shí)別和切割核苷酸序列，這些片段通過(guò)凝膠電泳法進(jìn)行分離、鑒別［19］。線粒體DNAA1555G突變檢測(cè)試劑盒和大前庭水管相關(guān)PDSIVS7-2A-G突變檢測(cè)試劑盒均采用的這種方法。

2.2 序列測(cè)定 核酸序列測(cè)定是基因研究的重要手段，目前傳統(tǒng)的手工測(cè)序方法及儀器自動(dòng)測(cè)序方法均使用雙脫氧鏈終止法。實(shí)驗(yàn)室所使用的全自動(dòng)基因測(cè)序儀多數(shù)是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司所開(kāi)發(fā)。主要分為測(cè)序模板的制備、測(cè)序反應(yīng)PCR、測(cè)序反應(yīng)PCR純化、上機(jī)檢測(cè)等步驟?；蛐蛄袦y(cè)定已成為許多遺傳性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，此項(xiàng)技術(shù)對(duì)人類(lèi)認(rèn)知疾病，診斷疾病以及預(yù)防疾病都有著深遠(yuǎn)的意義［20］。

2.3 變性高效液相色譜技術(shù) 是一種基因檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，采用DNA SepCartridge分離柱進(jìn)行核酸片段的分離和分析，通過(guò)色譜圖判斷序列突變非常直觀。雖然DHPLC是一個(gè)定性的篩查技術(shù)，最終要通過(guò)測(cè)序確定突變類(lèi)型，但通過(guò)色譜圖可看出不同突變的圖形都有各自的特點(diǎn)，借此可初步推測(cè)突變類(lèi)型。優(yōu)點(diǎn)：可以進(jìn)行基因大片段缺失檢測(cè)、染色體多倍體和大片段缺失檢測(cè)、定量分析，方法準(zhǔn)確、操作容易、檢測(cè)隨機(jī)性、結(jié)果快速性、樣品高通量性、消耗品低價(jià)性等。局限性：雖然可檢測(cè)1.5kb片段大小，最佳檢測(cè)大小為200～450bp；對(duì)PCR的產(chǎn)量和質(zhì)量要求高；不能檢測(cè)大片段缺失、插入及一個(gè)或幾個(gè)外顯子的丟失［20］。目前可采用此種方法進(jìn)行SLC26A4突變基因的篩查。

2.4 基因芯片 又稱(chēng)DNA芯片、寡核苷酸微陣列。是通過(guò)光刻原位合成或點(diǎn)樣技術(shù)，將已知序列的DNA或寡核苷酸片段按特定順序密度地固定在玻璃等支持物上所組成的DNA／cDNA探針陳列。針對(duì)國(guó)人常見(jiàn)耳聾相關(guān)基因熱點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)的耳聾基因芯片對(duì)非綜合性重度和極重度耳聾患者的突變檢出率高。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，它具有快速、高通量、高準(zhǔn)確性、低成本等特點(diǎn)。更重要的是它可以同時(shí)檢測(cè)多突變位點(diǎn)，這是傳統(tǒng)方法無(wú)法解決的問(wèn)題。由我國(guó)研發(fā)的耳聾基因診斷芯片，采用的是基因芯片的方法，主要針對(duì)的是GJB2、GJB3、SLC26A4以及線粒體DNA 4種基因9個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)。

3 耳聾基因診斷在遺傳性耳聾預(yù)防和阻斷中的意義

從20世紀(jì)80年代年代到目前為止，很多國(guó)家都已經(jīng)進(jìn)行了耳聾的預(yù)防和阻斷，通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩查，早期發(fā)現(xiàn)聽(tīng)力減退的患兒，采取一定的措施來(lái)保證患兒的正常發(fā)育。但這僅僅是從聽(tīng)力學(xué)的角度進(jìn)行的檢測(cè)，無(wú)法從根本上解釋耳聾的病因，以及進(jìn)行耳聾的預(yù)防和阻斷。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，人們對(duì)耳聾的研究也越來(lái)越深入，已經(jīng)從分子遺傳學(xué)上找到了耳聾的真正病因，這為從根本上預(yù)防和阻斷耳聾奠定了理論基礎(chǔ)。但由于耳聾高度遺傳異質(zhì)性的特點(diǎn)，給耳聾的分子學(xué)診斷及預(yù)防帶來(lái)了一定的困難。對(duì)于我國(guó)來(lái)說(shuō)，首先我們必須認(rèn)識(shí)中國(guó)人耳聾的真正病因，特別是各種遺傳性致病因素，以及耳聾相關(guān)基因的特點(diǎn)才有可能采取相應(yīng)的預(yù)防和阻斷措施。解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心自2003年起進(jìn)行了全國(guó)范圍的聾病分子流行病學(xué)調(diào)查，共收集28個(gè)地區(qū)聾啞人病例及DNA標(biāo)本3 564例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)21%的聾人帶有GJB2基因突變（其中15%為雙等位基因突變）；14.5%的聾人帶有SLC26A4基因突變（其中10.5%為雙等位基因突變）；另分別有3.8%和0.6%的聾人帶有線粒體DNA A1555G和C1494T突變［9］。因此對(duì)廣大中國(guó)聾人群體的常見(jiàn)遺傳病因的調(diào)查和分析結(jié)果可以指導(dǎo)遺傳性耳聾的總體預(yù)防。中國(guó)聾兒中GJB2、SLC26A4和線粒體基因突變導(dǎo)致的耳聾比例非常高的事實(shí)也催生了新的耳聾預(yù)防思路和方法的誕生［21］。

3.1 藥物性耳聾敏感個(gè)體的篩查和發(fā)現(xiàn)是前瞻性預(yù)防藥物性耳聾發(fā)生地科學(xué)方法 大量的研究證實(shí)，線粒體突變與耳聾關(guān)系密切，目前確定與藥物性耳聾發(fā)病密切相關(guān)的線粒體DNA突變是A1555G和C1494T，通過(guò)進(jìn)行線粒體基因突變篩查，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)敏感個(gè)體，對(duì)其未發(fā)病的母系家庭成員進(jìn)行預(yù)防宣教，告之終身禁用氨基糖甙類(lèi)抗生素，使他們避免接觸危險(xiǎn)環(huán)境而使聽(tīng)力得到保護(hù)［21］。

3.2 認(rèn)識(shí)青少年聾人的遺傳性病因是預(yù)防“聾聾”垂直傳遞的基本 在聾人社會(huì)中比較流行聾-聾婚配的模式，這就意味著耳聾的同證婚配會(huì)導(dǎo)致耳聾出生缺陷率大幅度的升高。我們可以在聾人婚戀前鑒定常見(jiàn)遺傳性耳聾的基因型，據(jù)此指導(dǎo)聾人之間的基因互補(bǔ)型婚姻，避免悲劇的再次發(fā)生［22］。

3.3 耳聾基因診斷配合產(chǎn)前診斷是保障耳聾家庭再生育的關(guān)鍵技術(shù) 基于基因診斷的耳聾遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷可使咨詢(xún)對(duì)象獲得更加科學(xué)準(zhǔn)確的遺傳信息，通過(guò)后續(xù)的遺傳指導(dǎo)和必要的干預(yù)措施，最終達(dá)到防止聾兒后代出生、減少耳聾發(fā)病率的目的。

3.4 新生兒的聽(tīng)力篩查和基因篩查聯(lián)合應(yīng)用是一個(gè)具有很好前景的革命性工作 近10年全國(guó)范圍開(kāi)展的新生兒聽(tīng)力篩查存在一個(gè)重大的局限或缺陷，即并不是所有的聽(tīng)力損失均會(huì)在出生后立即表現(xiàn)出來(lái)。因此將聽(tīng)力篩查和基因篩查聯(lián)合應(yīng)用作為早期發(fā)現(xiàn)處于語(yǔ)前聽(tīng)力損失或遲發(fā)型高?；純旱姆椒ǎ悄壳白顬橛辛Φ暮Y查策略［23］。其意義在于：①對(duì)于先天性聽(tīng)力損傷患兒至少40%可以明確病因；②可早期發(fā)現(xiàn)處于語(yǔ)前聽(tīng)力損失或遲發(fā)型的高?；純海壳白顬橛辛Φ暮Y查策略）；③更為重要可以發(fā)現(xiàn)大量潛伏的耳聾基因攜帶者。

盡管在聾人社會(huì)和家庭進(jìn)行耳聾基因篩查和預(yù)防具有投入少、產(chǎn)出大特點(diǎn)，但由于中國(guó)人常見(jiàn)耳聾突變的攜帶率非常高，僅依賴(lài)聾人的篩查和干預(yù)尚不足以從根本上阻止遺傳性耳聾在整個(gè)人群中的傳遞和發(fā)病。年輕夫婦在婚檢或生育前進(jìn)行耳聾基因突變的篩查，是前瞻性阻止可診斷的遺傳性耳聾下傳的科學(xué)方法，這一過(guò)程也可以提前到新生兒出生后，其優(yōu)越性在于及早發(fā)現(xiàn)的遲發(fā)性遺傳性耳聾，予以用藥指導(dǎo)、早期治療、干預(yù)和康復(fù)，對(duì)于其成年后的配偶選擇和優(yōu)生優(yōu)育作出指導(dǎo)。

綜上所述，隨著基因組科學(xué)的進(jìn)步和對(duì)中國(guó)人遺傳性耳聾認(rèn)識(shí)的深入，遺傳性耳聾預(yù)防和阻斷的時(shí)代已經(jīng)到來(lái)，科學(xué)的預(yù)防理念、準(zhǔn)確全面的基因診斷和篩查技術(shù)、配套的遺傳咨詢(xún)和干預(yù)體系、全體國(guó)民的知識(shí)普及和教育將是規(guī)模化預(yù)防中國(guó)遺傳性耳聾出生和藥物性耳聾發(fā)生的關(guān)鍵。

4 耳聾基因診斷目前存在的問(wèn)題及展望

耳聾基因診斷目前在我國(guó)是剛剛起步，在預(yù)防遺傳性耳聾中還存在著很多的問(wèn)題。第一，目前國(guó)內(nèi)外基因檢測(cè)的主要方法是測(cè)序法，此方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、價(jià)格昂貴，一般的醫(yī)療機(jī)構(gòu)很難開(kāi)展，僅僅應(yīng)用于科研機(jī)構(gòu)。因此臨床上需要一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的基因檢測(cè)方法—耳聾基因芯片應(yīng)運(yùn)而生。它的檢出率高、通量高、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)使它開(kāi)始在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。第二，由于人類(lèi)基因組的復(fù)雜性及耳聾基因的高度遺傳異質(zhì)性，加大了基因檢測(cè)的難度，給遺傳性耳聾的診斷及預(yù)防帶來(lái)了一定的困難。因?yàn)榈侥壳盀橹梗阎亩@基因很多，尚還有待發(fā)現(xiàn)的未知基因，因此一些檢測(cè)的結(jié)果并不理想（有的基因并未檢測(cè)到），這給遺傳咨詢(xún)工作帶來(lái)了一定的困擾。隨著人們對(duì)遺傳性耳聾認(rèn)識(shí)的深入以及基因芯片檢測(cè)方法的完善，相信遺傳性耳聾基因檢測(cè)在預(yù)防和阻斷聾兒的出生，降低我國(guó)出生缺陷率的工作中將發(fā)揮著重要的作用。

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