惡性瘧原蟲多藥抗性蛋白pfMRP1研究新進(jìn)展*

徐淑慧(綜述),楊照青

近幾年在瘧疾的治療中,抗瘧藥抗藥性的產(chǎn)生成為瘧疾控制的最大難題,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,從分子水平上研究惡性瘧原蟲的抗藥性的產(chǎn)生取得了重大突破性進(jìn)展,惡性瘧原蟲多藥抗性蛋白pfMRP1(The P.falciparum M ultid rug Resistance Protein 1)被認(rèn)為是和多種藥物抗性產(chǎn)生有關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與抗瘧藥抗性的產(chǎn)生有密切關(guān)系。

1 惡性瘧原蟲多藥抗性蛋白pfMRP1與ATP結(jié)合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC蛋白)

在瘧疾的治療中,瘧原蟲尤其惡性瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生,嚴(yán)重影響了瘧疾的有效控制,瘧原蟲抗藥性產(chǎn)生的潛在機(jī)制是復(fù)雜多因的,導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生的最重要的因素是藥物到達(dá)不了它的靶點(diǎn),這歸因于瘧原蟲基因組中有一種活性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,我們叫它多藥抗性蛋白(MDR/MRP),大部分多藥抗性蛋白屬于A TP結(jié)合盒式蛋白[1](ATP-binding cassette transporter,ABC蛋白),ABC蛋白是一個古老而龐大的蛋白質(zhì)家族,是一類A TP驅(qū)動泵。1976年首次有文獻(xiàn)報道ABC蛋白是癌癥藥物治療中對多種天然藥物產(chǎn)生抗性中表現(xiàn)為170 kDa P-糖蛋白,后來,轉(zhuǎn)染實驗提供了確切的證據(jù),在哺乳細(xì)胞中第2次發(fā)現(xiàn)ABC蛋白的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的多藥抗藥性(MRP)密切相關(guān),是導(dǎo)致化療失敗的主要原因,約 40%的患者的癌細(xì)胞內(nèi)該基因過度表達(dá)[2]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括P-糖蛋白、多藥抗藥相關(guān)蛋白和乳腺癌抗藥蛋白,它們屬于同一家族,具有保守的功能結(jié)構(gòu)域和多樣化的生物學(xué)功能。MRPs多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是其中一種,能利用水解ATP的能量將各種藥物從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,這個新的分類定義了多藥抗性蛋白(MRPs).在體內(nèi)和體外研究中指出了它和抗藥性的相關(guān)性[3-4]。

已經(jīng)確定的惡性瘧原蟲ABC蛋白質(zhì)超家族有16個成員,其中11個被認(rèn)為是藥物流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,現(xiàn)在展開的P f ABC基因系統(tǒng)分析法把ABC超家族分為7個亞科群,亞科B是最大的,包含有7個成員,別的和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的家族成員有P f ABCC1,P f ABCC2、P f ABCG1和 P f ABCI3 。決定 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和定位的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有3個P f MRP1,P f MRP2,和P f MDR5,存在于無性繁殖階段的寄生蟲的細(xì)胞膜上[5]。這些活躍在蛋白質(zhì)膜上的特殊物質(zhì)可以泵出很多在結(jié)構(gòu)和功能上不同的兼性藥物,從而減少細(xì)胞內(nèi)的藥物聚集,導(dǎo)致藥物產(chǎn)生抗性。

ABC蛋白的典型結(jié)構(gòu)包括6個跨膜片段形成的跨膜區(qū)(TMD)的和w alker A和walker B基序形成的核苷酸結(jié)合區(qū)(NBD),ABC蛋白也編碼完全轉(zhuǎn)運(yùn)體(TMD-NBD-TMD-NBD)或部分轉(zhuǎn)運(yùn)體(TMD-NBD),用來轉(zhuǎn)化結(jié)合一個功能單位[6],其中pfMRP1和pfMRP2是完全轉(zhuǎn)運(yùn)體,P f MDR5是半轉(zhuǎn)運(yùn)體。除它的正常生理功能之外,近年發(fā)現(xiàn),ABC蛋白廣泛存在于多種正常的組織和器官,參與藥物和內(nèi)、外源毒素的吸收、分布和排泄,行使解毒和防御保護(hù)的作用。

2 pfMRP1在抗瘧藥中的作用

p fMRP1在抗瘧藥中的作用是近幾年瘧疾研究中的重點(diǎn),pfMRP1的蛋白質(zhì)編碼PFA 0590w,(http://p lasmodb.org/)由 1 822個氨基酸組成,HMMTOPv2軟件分析pfMRP1的二級結(jié)構(gòu)由12個雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成,分布在兩個跨膜區(qū)(MSDs),在NDB附近形成典型短的MRP[4],幾個已經(jīng)確定的突變位點(diǎn)都位于 pfMRP1基因的功能區(qū)MSDs,NBDs附近,位于這些區(qū)域可以控制它的底物特異性和增加ATP結(jié)合水解蛋白的能力[7],這些結(jié)構(gòu)的天然變異提示pfMRP1具有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,最近有文獻(xiàn)報道更進(jìn)一步表明,pfM RP1的分解降低了瘧原蟲把氧化廢物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的能力,使瘧原蟲對周圍的環(huán)境敏感性增加,體外研究中也發(fā)現(xiàn)使瘧原蟲對氯喹,奎寧,青蒿素,哌喹和伯氨喹的敏感性增加[4],臨床藥效試驗中發(fā)現(xiàn)I876突變在蒿甲醚-本芴醇(AL)治療后復(fù)發(fā)的病例中的選擇性,K 1466突變在磺胺多辛-乙胺嘧啶(S-P)治療后復(fù)發(fā)的病例中的選擇性[8],而且,在抗瘧藥體外試驗中發(fā)現(xiàn),pfMRP1的突變可以降低所有藥物敏感性,除了咯萘啶,所有這些研究有力的說明了pfMRP1和幾種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗瘧藥都有關(guān),由此推理了抗瘧藥的抗藥性機(jī)制,尤其揭示了當(dāng)前以青蒿素為基礎(chǔ)的綜合治療(ACT)的抗藥性機(jī)制,pfM RP1是青篙素和ACT其他成員的產(chǎn)生交叉抗性的基礎(chǔ)。在氯喹和奎寧的體外研究中揭示了pfMRP1的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,可以將各種藥物從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外,從而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度,使細(xì)胞對藥物產(chǎn)生抗藥性[4]。MRPs有個特殊的機(jī)制影響藥物的抗性,就是通過增加物質(zhì)量對抗藥物轉(zhuǎn)運(yùn),這尤其對藥物的特異性靶點(diǎn)有作用,這一機(jī)制在抗葉酸素的研究中普遍存在[9]。

最近研究還表明,pfMRP1轉(zhuǎn)運(yùn)抗瘧藥和細(xì)胞膜上氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān),通過對大量受捐者誘導(dǎo)氧化應(yīng)激實驗,可以得出在惡性瘧原蟲中pfMRP1起著一個重要的GSSG流出泵作用,這種泵作用也可以在人類MRPs中觀察到[10],這揭示了pfMRP1具有多樣化的生物學(xué)特性。

3 pfMRP1單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象對不同藥物的特異性

pfMRP1有個重要的功能是可以降低氯喹、奎寧、青蒿素的敏感性,它的多態(tài)現(xiàn)象增加了所有蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)功能從而降低了所有相關(guān)藥物的敏感性,也可以通過降低蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率而增加藥物的敏感性,除了S-P,pfMRP1多態(tài)現(xiàn)象對S-P的選擇性不大,這一觀點(diǎn)在乙胺嘧啶和青蒿素的抗藥性研究中已經(jīng)得到證實,pfMRP1多態(tài)現(xiàn)象介導(dǎo)了青蒿素和ACT中當(dāng)前運(yùn)用的其他藥物的交叉抗性,增加一種藥物的pfM RP1的活性可以降低ACT成員中所有藥物的敏感性,包括本芴醇,甲氟喹和阿莫地喹[4],這是當(dāng)前瘧疾治療的最大難題。

這里有三個因素解釋我們觀察到的不同的突變位點(diǎn)影響不同藥物的敏感性的原因,盡管這些都是pfMRP1的潛在轉(zhuǎn)運(yùn)功能。(1)最重要的因素是pfMRP1有藥物特異性,即使MRP的酶結(jié)合位點(diǎn)有重疊,突變位點(diǎn)只是有助于有些酶的結(jié)合,而不是所有酶的結(jié)合,導(dǎo)致了核苷酸多態(tài)性只和特定藥物有關(guān)系。(2)可能pfMRP1在甲氟喹和本芴醇在細(xì)胞質(zhì)靶點(diǎn)中的作用比在食物泡的靶點(diǎn)靶點(diǎn)更重要,氯喹,阿莫地喹也是這樣。(3)有些藥物可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),pfMRP1的附加效應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)GSSG,把細(xì)胞從氧化壓力下解救出來[11],轉(zhuǎn)運(yùn)GSSG和藥物有不同的酶結(jié)合位點(diǎn)[4]。

4 pfMRP1,pfMDR1和pfCRT在抗藥性產(chǎn)生過程中的協(xié)同作用

pfMRP1潛在影響抗藥性方面和其他惡性瘧原蟲膜轉(zhuǎn)運(yùn)體有協(xié)同作用,比如惡性瘧原蟲多藥抗性基因 PfMDR1和惡性瘧原蟲氯喹抗性相關(guān)基因P f CRT。

PfMDR1是食物泡膜的輸入者,逆方向影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn),野生型突變位點(diǎn)和基因擴(kuò)增可以降低甲氟喹,本芴醇和青篙素等藥物的敏感性,而會增加氯喹和阿莫地喹的敏感性,甲氟喹,本芴醇在食物泡外面有它的靶點(diǎn)[12],PfMDR1對食物泡的轉(zhuǎn)運(yùn)效率可以通過各自的靶點(diǎn)降低這些藥物的敏感性,相反的,PfMDR1在比較低的轉(zhuǎn)運(yùn)效率情況下可以增加氯喹和阿莫地喹的敏感性,這可能是因為它的靶點(diǎn)在食物泡內(nèi)部的原因。

P f CRT是食物泡膜的輸出者,最初是在氯喹的抗藥性中發(fā)現(xiàn)的,P f CRT的天然76T突變比野生型的突變有更好的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,P f CRT可以使藥物從食物泡中溢出,這將降低氯喹和阿莫地喹的敏感性,當(dāng)P f CRT返回到它的作用部位,到甲氟喹和本芴醇的靶點(diǎn),又會增加甲氟喹和本芴醇的敏感性。

pfMRP1以相同的方式影響大多數(shù)藥物,它對抗瘧藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響是顯而易見的,直接作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。但它可以通過P f CRT對藥物的活動,進(jìn)一步作用于食物泡藥物的靶點(diǎn)[13],可見,這幾種抗藥性基因共同影響藥物的抗藥性。

5 pfMRP1基因突變的類型特點(diǎn)和基因突變的檢測方法

在對pfMRP1基因的研究中,目前確定的多態(tài)性(SNPs)一共有4個,這幾個點(diǎn)突變導(dǎo)致編碼氨基酸的密碼子發(fā)生改變,分別為 Y 191H和A 437S,I876V和K 1466R,這幾個突變位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)功能區(qū)附近(特別是NBDs)[3]。pfMRP1有顯著的生物多樣性,一些已經(jīng)確定的多態(tài)性有地域性的特點(diǎn)。在非洲的瘧疾感染樣本中,I876V和 K 1466R的突變比較常見,K 1466R突變只有在非洲和新幾內(nèi)亞島樣本中檢測到,I876V突變現(xiàn)象遍及全球瘧疾流行區(qū),在亞洲和大洋洲的樣本中最常見的突變位點(diǎn)是Y191H和A 437S[14],這2個位點(diǎn)的突變率很高。

對pfMRP1基因突變的檢測最直接和有效的方法就是進(jìn)行DNA測序分析,各大洲的惡性瘧分離株上的突變位點(diǎn)都是通過這種方法發(fā)現(xiàn)的[15]。但是若對待測樣本全部進(jìn)行DNA測序,成本較高,無法廣泛應(yīng)用,針對 Y191H和A 437S,I876V和K 1466R這幾個突變位點(diǎn)在惡性瘧原蟲抗藥性中的關(guān)鍵作用,如果能夠檢測到這一位點(diǎn)的突變與否,就能初步判該株惡性瘧原蟲是否為抗性株。這就需要設(shè)計特定引物通過PCR擴(kuò)增出包含這幾位氨基酸密碼子的DNA片段進(jìn)行分析,目前國外已經(jīng)有報道通過巢式PCR法擴(kuò)增出包含這幾個突變位點(diǎn)密碼子的DNA片段[9],再通過特異性的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的限制性長度多態(tài)性分析(RFLP),通過酶切片段的不同來判斷是否存在基因突變 。巢式PCR法是用兩套引物(內(nèi)、外引物)作兩輪PCR,第1輪PCR擴(kuò)增出一段較長片段,作為第2輪PCR的模板再進(jìn)行擴(kuò)增,使用巢式引物進(jìn)行多輪擴(kuò)增提高了PCR反應(yīng)的特異性和靈敏度,這樣可以提高實驗結(jié)果的可信度和可靠度。

6 結(jié) 語

pfMRP1在瘧疾抗藥性產(chǎn)生中發(fā)揮很重要的作用,我們可以通過分子生物學(xué)技術(shù),掌握它的生物多樣性的特點(diǎn),對位于MSDs,NBDs功能區(qū)附近的突變位點(diǎn)進(jìn)行研究,檢測出各個瘧疾流行區(qū)對特定藥物的敏感性,指導(dǎo)臨床用藥及新的抗瘧藥的研制,降低藥物產(chǎn)生抗性的概率,控制瘧疾的流行和傳播。

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