李 娜,劉鵬飛,李波清,喬媛媛,張玉梅

2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,煙臺 264003

Ipr1對巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響*

李 娜1,劉鵬飛2,李波清1,喬媛媛1,張玉梅1

目的應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測Ipr1的表達(dá)對巨噬細(xì)胞感染分枝桿菌H37Ra后參與免疫應(yīng)答的相關(guān)基因的表達(dá)差異。方法實驗組與對照組細(xì)胞分別感染分枝桿菌H37Ra,基因芯片檢測實驗組和對照組細(xì)胞感染H37Ra 96h后免疫相關(guān)基因表達(dá)差異。定量PCR反應(yīng)檢測芯片結(jié)果中上調(diào)的3個基因的表達(dá)差異用以驗證芯片結(jié)果的可靠性。結(jié)果基因芯片檢測結(jié)果顯示Ipr1基因的表達(dá)上調(diào)了11個固有免疫機(jī)制中相關(guān)基因表達(dá),其中與MΦ抗Mtb感染關(guān)系密切的基因有:TLR2、TLR4、Irak1、Traf6、Ifngr1、Tnfrsf1a,而參與調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的相關(guān)基因如:IL-1,IL-12無明顯表達(dá)差異。結(jié)論

Ipr1增強(qiáng)MΦ抗Mtb感染的機(jī)制可能主要是通過上調(diào)MΦ抗感染固有免疫機(jī)制的有關(guān)基因的表達(dá)從而發(fā)揮抗菌作用。本實驗為進(jìn)一步研究Ipr1促進(jìn)MΦ的活化及殺傷胞內(nèi)吞噬的Mtb的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

Ipr1;結(jié)核分枝桿菌;巨噬細(xì)胞

結(jié)核病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,全球每年約有800萬新發(fā)病例,170多萬人死亡,死亡數(shù)居單一傳染病之首[1]。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)為細(xì)胞內(nèi)寄生菌。越來越多的研究表明固有免疫應(yīng)答在抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮著重要的作用。而巨噬細(xì)胞(MΦ)是固有免疫應(yīng)答中最主要的細(xì)胞,它是機(jī)體抗Mtb感染的第一道防線[2-3],2005年,Pan等在小鼠MΦ內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個介導(dǎo)MΦ抗胞內(nèi)病原體的基因—胞內(nèi)病原體抗性基因1(intracellular pathogen resistance 1,Ipr1),該基因具有體外調(diào)節(jié)MΦ對Mtb反應(yīng)能力的作用[4]。

本實驗室已成功構(gòu)建Ipr1基因真核表達(dá)基因pEGFP-Ipr1并且驗證Ipr1基因產(chǎn)物表達(dá)部位位于細(xì)胞核內(nèi)[5]。在本研究中將利用基因芯片技術(shù)研究Ipr1基因的表達(dá)與M Φ抗分枝桿菌感染固有免疫相關(guān)機(jī)制之間是否有著某種相互關(guān)聯(lián),從而為闡明Ipr1在MΦ抗結(jié)核病固有免疫中的機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和菌株 質(zhì)粒pEGFP-Ipr1由本實驗室構(gòu)建保存,質(zhì)粒pEGFP-C1、細(xì)胞株RAW264.3由本實驗室保存。分枝桿菌減毒株H37Ra為北京藥品生物制品檢定所提供(菌號93020)。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基干粉、1∶125胰蛋白酶(美國Gibco公司);6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Costar公司);胎牛血清(杭州四季青公司);真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000(Invitrogen公司);M7H9培養(yǎng)基干粉、M7H10培養(yǎng)基干粉及OADC enrichment(Difco公司)。美國SuperArray公司的小鼠固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答基因芯片(Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray)購自上海康成公司。

1.3 穩(wěn)定表達(dá) Ipr1的 RAW264.7篩選RAW264.7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pEGFP-Ipr1及空質(zhì)粒pEGFP-C1,G418篩選穩(wěn)定表達(dá)Ipr1的RAW264.7細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的 RAW264.7細(xì)胞[6],分別命名為實驗組及對照組。

1.4 結(jié)核分枝桿菌H37Ra的培養(yǎng)及細(xì)菌懸液的準(zhǔn)備 挑取改良羅氏培養(yǎng)基上處于對數(shù)生長期的新鮮分枝桿菌H37Ra菌落,以0.05%吐溫鹽水充分研磨后,接種M7H9液體培養(yǎng)基,37℃靜止培養(yǎng)約3 w后,密閉離心棄上清,以高壓滅菌的0.9%生理鹽水反復(fù)淘洗后自然沉淀3次,每次10min,取上清,無血清RPMI1640培養(yǎng)液重新調(diào)整細(xì)菌濃度為1×107/mL制成細(xì)菌懸液備用。

1.5 分枝桿菌H37Ra感染巨噬細(xì)胞及細(xì)胞吞噬細(xì)菌量檢查 經(jīng)G418篩選得到的實驗組細(xì)胞與對照組細(xì)胞常規(guī)用含10%胎牛血清、600μ g/mL G418的RPMI 1 640培養(yǎng)液在 5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞狀態(tài)良好,將實驗組細(xì)胞和對照組細(xì)胞分別用0.25%的胰蛋白酶消化并收獲細(xì)胞,轉(zhuǎn)種至6孔板,每孔細(xì)胞數(shù)為1×106,同時常規(guī)制備6孔板細(xì)胞爬片用于抗酸染色。繼續(xù)用含10%胎牛血清、600μ g/mL G418的 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁換用無G418、無抗生素的含10%胎牛血清 RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,同時加入PMA,使其終濃度為 100nmol/L。24h后,將前述準(zhǔn)備的分枝桿菌H37Ra細(xì)菌懸液按細(xì)胞∶細(xì)菌=1∶10的比例加入到6孔板的實驗組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi),5%CO2、37℃培養(yǎng)6h,用含1%胎牛血清的PBS洗滌3次,洗去未被MΦ吞噬的細(xì)菌,換入新鮮的不含抗生素的完全RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)(為便于描述將此時間點計為0h)。之后每隔6h將細(xì)胞用含1%胎牛血清的PBS洗滌3次,換入新鮮不含抗生素的完全RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)。24h后將細(xì)胞常規(guī)洗滌3次取出實驗組和對照組細(xì)胞爬片進(jìn)行抗酸染色觀察MΦ吞噬細(xì)菌情況。

1.6 基因芯片檢測 細(xì)菌感染96h后,抽提6孔板中各組細(xì)胞總RNA。提取的的總RNA標(biāo)本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性及紫外分光光度計檢測OD值以確定其純度及濃度。按相關(guān)試劑盒說明進(jìn)行cDNA的合成及線性生物素標(biāo)記的cRNA的合成、擴(kuò)增及純化。按Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray基因芯片檢測說明書進(jìn)行芯片雜交。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測芯片雜交結(jié)果。X射線膠片曝光在膠片上顯示檢測結(jié)果。X-射線膠片曝光后,將膠片上的圖象用Microtek 120TF掃描儀(上海中晶)掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。使用配套軟件GEArray Expression Analysis Suite對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析。計算待檢基因表達(dá)水平占該看家基因表達(dá)水平的百分率然后比較對照組及實驗組特定基因表達(dá)水平的差異。

1.7 Real-time PCR檢測 為驗證芯片檢測結(jié)果的可靠性選取上述基因芯片檢測結(jié)果中上調(diào)的3個基因進(jìn)行Real-time PCR檢測。應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer 5,分別設(shè)計了3個待檢基因及內(nèi)參GAPDH的上下游引物:GAPDH F 5′AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC 3′R 5′TCCACCACCCTGT TGCTGTA 3′;Ifngr1 F 5′CT TTGACGAGCACTGAGGA 3′R 5′CCAGGAACCCGAATACACC 3′;Tlr2 F 5′TGTCGT TCAAGGAGGTGCG 3′R 5′TCCAGAAGAGCCAAAGAGC 3′;Tlr4 F 5′GAGAATCTGGTGGCTGTGG 3′R 5′T TCCCTGAAAGGCT TGGTC 3′。采用上述方法進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及感染細(xì)胞,RNA抽提及 RT-PCR合成cDNA方法同基因芯片檢測。制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板:針對每一需要測量的基因和管家基因,選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋,設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1,分別稀釋為1×10-1,1×10-2,1×10-3,1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7這幾個梯度濃度的DNA。幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有GAPDH 、Ifngr1、Tlr2 、T lr4 cDNA 樣品分別配置 Realtime PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng),分別在86℃、85℃、81℃、85℃收集熒光。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線,各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度,即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá) Ipr1的 RAW264.7篩選 轉(zhuǎn)染pEGFP-Ipr1質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)G418壓力篩選6W,獲得具有抗性的陽性克隆,經(jīng)RT-PCR鑒定正確即為穩(wěn)定表達(dá)Ipr1的細(xì)胞(實驗組),倒置熒光顯微鏡下觀察可見熒光集中在細(xì)胞核內(nèi)見圖1-1。空質(zhì)粒 pEGFP-C1轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞經(jīng)G418篩選6W倒置熒光顯微鏡觀察可見熒光表達(dá)于整個細(xì)胞(對照組),見圖1-2。

圖1.1 熒光顯微鏡觀察G418篩選6w的轉(zhuǎn)染pEGFP-Ipr1的 RAW264.7細(xì)胞 ×250圖1.2 熒光顯微鏡觀察G418篩選6w的轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的 RAW264.7細(xì)胞 ×250Fig.1.1 6w after teansfection of RAW264.7 cellswith pEGFP-Ipr1×250Fig.1.2 6w after teansfection of RAW264.7 cellswith pEGFP-C1×250

2.2 分枝桿菌H37Ra細(xì)胞感染 實驗組細(xì)胞和對照組細(xì)胞在感染H37Ra 24h后,抗酸染色觀察可見約70%的細(xì)胞至少吞噬了1個抗酸菌,平均每個細(xì)胞吞噬20個左右的抗酸菌,表明H37Ra成功感染了實驗組和對照組RAW264.7,見圖2.1,2.2。

圖2.1 實驗組RAW264.7感染 H37Ra 24h;抗酸染色×1000圖2.2 對照組RAW264.7感染H37Ra 24h;抗酸染色×1000Fig.2.1 The experimental group RAW264.7 cells infected with H37Ra for 24h×1000Fig.2.2 The control group RAW264.7 cells infected with H37Ra for 24h×1000

2.3 總RNA的抽提及質(zhì)量檢測 實驗組和對照組細(xì)胞抽提的總RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA的28s和18s rRNA帶型清晰且28s亮度是18s亮度的2倍以上,表明總RNA較完整,見圖3。經(jīng)紫外吸收測定OD值,實驗組標(biāo)本和對照組標(biāo)本的OD260/OD280值分別為2和1.98,表明提取的總RNA純度較高,可以用于后續(xù)實驗。實驗組標(biāo)本和對照組標(biāo)本總RNA濃度分別是1 765.56 ng/μ L和 1 486.74 ng/μ L。

2.4 基因芯片雜交化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果 實驗組標(biāo)本和對照組標(biāo)本所得的線性生物素標(biāo)記的cRNA與小鼠Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray芯片雜交后,經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測,X-膠片成像結(jié)果見圖4-1、4-2。

圖3 實驗組與對照組RAW264.7細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Result of the experimental group cells and the control group cells total RNA

經(jīng)GEArray Expression Analysis Suite軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析,比較實驗組及對照組特定基因表達(dá)水平的差異。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組較對照組有11個基因表達(dá)上調(diào)大于2倍,其中包括T LRs及其信號通路的基因:TLR2、T LR4、Irak1、Traf6;干擾素γ受體相關(guān)基因:Ifngr1(IFN-γ R1);腫瘤壞死因子受體相關(guān)基因:Tnfrsf1a(TNFR1);細(xì)胞識別及細(xì)胞間相互作用相關(guān)基因:Lbp、Fcgr1、Colec12;炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因:Cebpe、T rem1。這些基因表達(dá)上調(diào)主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)MΦ固有免疫應(yīng)答能力,而與MΦ調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)的一些細(xì)胞因子如 IL-1、IL-12、TNF-α等的表達(dá)卻無明顯差異。表1列出實驗組比對照組表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因。

圖4-1 實驗組細(xì)胞感染H37Ra 96h后cDNA基因芯片檢測結(jié)果圖4-2 對照組細(xì)胞感染H37Ra 96h后cDNA基因芯片檢測結(jié)果Fig.4-1 cDNA expression array result of the experimental group cells infected with H37Ra for 96 hFig.4-2 cDNA expression array result of the control groupcells infected with H37Ra for 96 h

表1 實驗組比對照組表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因Table 1 Two fold up-regulated genes between test and control

2.5 Real-time PCR檢測結(jié)果 Real-time PCR驗證芯片結(jié)果中上調(diào)的3個基因Ifngr1、Tlr2、T lr4的表達(dá),結(jié)果用Ct值表示樣本中測定模板的起始拷貝數(shù)。Ct值越小,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越大,起始拷貝數(shù)越小。通過制備每個目的基因的樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線保證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性和專一性。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)R2＞0.99,擴(kuò)增效率在0.83～1.0之間。結(jié)果顯示兩個樣本中內(nèi)參的表達(dá)量非常接近,而Ifngr1、T lr2、Tlr4的表達(dá)量有差異,見表2。經(jīng)計算其相對含量Ifngr1、Tlr2、Tlr4在實驗組的表達(dá)量分別為對照組的3.05、2.27、3.40倍,與芯片結(jié)果方向一致,結(jié)果非常接近,見表3與圖5,提示基因芯片檢測結(jié)果可靠。

表2 Ifngr1、Tlr2、Tlr4基因在兩個樣本中的相對表達(dá)量Table 2 The relative expression level of Ifngr1 、Tlr2 、Tlr4 in the two samples

表3 Real-time PCR對基因芯片結(jié)果的驗證Table 3 Verification of the results of microarray assay by real-time PCR

圖5 Real-time PCR對基因芯片結(jié)果的驗證Fig.5 Verification of the results of microarray assay by realtime PCR

3 討 論

Ipr1基因是新近發(fā)現(xiàn)的與小鼠結(jié)核病易感性相關(guān)的基因,目前的研究報道也僅限于在轉(zhuǎn)基因動物水平及體外細(xì)胞水平觀察到該基因的表達(dá)可以增強(qiáng)MΦ抗分枝桿菌等胞內(nèi)病原體的能力,但該基因的具體作用機(jī)制還并不明確。

本實驗為了檢測Ipr1的表達(dá)對M Φ抗分枝桿菌感染相關(guān)免疫基因表達(dá)的影響及Ipr1的表達(dá)是否與M Φ抗分枝桿菌感染的已知機(jī)制間有相互關(guān)聯(lián),我們應(yīng)用了基因芯片技術(shù)。SupperArray的小鼠先天性與適應(yīng)性免疫應(yīng)答基因芯片(Oligo Innate&Adaptive Immune Responses Microarray)列有目前研究的已知的參與機(jī)體抗微生物感染免疫應(yīng)答相關(guān)的113個基因位點,包括:IL-1R/TLRs成員及相關(guān)基因,與病原體識別有關(guān)的基因,炎癥反應(yīng)相關(guān)基因,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,NF-κ B信號通路相關(guān)基因,細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、趨化因子及相應(yīng)配體基因等。檢測不同標(biāo)本轉(zhuǎn)錄水平免疫應(yīng)答基因的表達(dá)差異。

在本實驗中,利用上述芯片檢測實驗組與對照組M Φ在感染H37Ra 96h后,相關(guān)免疫基因的表達(dá)差異。對基因芯片的結(jié)果分析我們發(fā)現(xiàn)Ipr1的表達(dá)主要是上調(diào)MΦ抗菌感染的免疫應(yīng)答基因的表達(dá),特別是MΦ固有免疫相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)尤為顯著。在表達(dá)上調(diào)的基因中,目前研究的較多的與M Φ抗Mtb等胞內(nèi)病原體感染關(guān)系較密切的有:參與 TLRs信號途徑的基因 TLR2、TLR4、Irak1、Traf6;IFN-γ受體基因Ifngr1及TNF-α受體基因Tnfrsf1a。

TLR2、T LR4、Irak1、T raf6 是參與 TLRs信號途徑的基因,已經(jīng)有大量的研究表明TLRs信號通路介導(dǎo)的MΦ抗Mtb感染在機(jī)體抗結(jié)核病的過程中發(fā)揮非常重要的作用。TLR2和T LR4是目前研究較多的與Mtb感染相關(guān)的TLRs。Mtb菌體成份或分泌成份含有一系列可以與 T LR2、T LR4相互作用的配體如LAM(脂阿拉伯甘露聚糖)、19kD脂蛋白、38kD糖脂蛋白、HSP70等,T LR2或 T LR4與相應(yīng)配體結(jié)合后,可通過MyD88依賴和非依賴途徑(TLR4)激活NF-κ B,引起多種炎癥性細(xì)胞因子的釋放及上調(diào)APC細(xì)胞表面CD80、CD86等共刺激分子,在早期抗感染固有免疫殺傷病原體及晚期調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答及形成肉芽腫的過程中均發(fā)揮重要作用[7]。在TLR2/T LR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑的MΦ活化過程中,M Φ內(nèi)的MyD88作為一種接頭蛋白與TLR2/T LR4胞內(nèi)區(qū)形成復(fù)合物,繼而招募并活化 IRAK-4、IRAK-1、T RAF-6,進(jìn)一步激活下游級聯(lián)反應(yīng)最終活化NF-κ B[8],最終促進(jìn)M Φ活化發(fā)揮胞內(nèi)殺菌及免疫調(diào)節(jié)功能?？梢娫诖诉^程中 IRAK-1、T RAF-6分子的參與與活化對TLRs信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)也有著重要意義。Ipr1基因上調(diào)上述基因的表達(dá)強(qiáng)烈提示Ipr1的表達(dá)可能與 TLR的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)有關(guān),并參與TLRs介導(dǎo)的M Φ抗Mtb免疫應(yīng)答。

γ干擾素(IFN-γ)是T細(xì)胞和NK細(xì)胞早期分泌的一種主要的Thl型細(xì)胞因子,在宿主M Φ控制Mtb感染過程中發(fā)揮非常重要的作用,IFN-γ主要通過刺激宿主MΦ產(chǎn)生一氧化氮合酶(NOS2)發(fā)揮抗Mtb感染作用[9]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是單核MΦ分泌的一種前炎癥性細(xì)胞因子,TNF-α與IFN-γ協(xié)同作用激活MΦ殺死細(xì)胞內(nèi)正在復(fù)制的Mtb,并與誘導(dǎo)Mtb感染的M Φ凋亡密切相關(guān)[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)Ipr1的表達(dá)上調(diào)了MΦIFN-γ R1基因的表達(dá),說明Ipr1的表達(dá)還可能通過增加MΦ對IFN-γ刺激的敏感性而發(fā)揮抗菌作用,而 TNF R1基因的表達(dá)上調(diào)也提示Ipr1的表達(dá)還可能參與促進(jìn)TNF-α介導(dǎo)的M Φ殺傷Mtb的過程及細(xì)胞凋亡。但是實驗結(jié)果中NOS2基因的表達(dá)在實驗組和對照組之間的差異卻并不明顯,也未檢測到與凋亡相關(guān)的基因 TNF-α、NF-κ B等基因的表達(dá)差異,可能是實驗設(shè)計中只是單獨應(yīng)用MΦ而未加入其它刺激因素的原因。

通過本實驗檢測到了Ipr1的表達(dá)上調(diào)了一系列MΦ抗菌免疫應(yīng)答基因的表達(dá),特別值得注意的是MΦ抗微生物感染的固有免疫應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá),包括TLR2/T LR4基因及信號通路有關(guān)的兩個基因Irak1、Traf6,以及與MΦ活化及殺傷胞內(nèi)病原體有關(guān)的細(xì)胞因子受體:Ifngr1、Tnfrsf1a。而參與MΦ調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子有關(guān)基因IL-1、TNF-α、IL-12等表達(dá)無明顯差異。提示 Ipr1的表達(dá)可能主要是通過增強(qiáng)MΦ固有免疫應(yīng)答的殺傷吞噬的Mtb機(jī)制,尤其是TLRs活化機(jī)制的作用進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗Mtb感染的能力,但究竟Ipr1是如何與T LRs活化機(jī)制間發(fā)生相互作用的以及Ipr1表達(dá)產(chǎn)物的作用位點仍需進(jìn)一步的研究。

[1]WHO.Global tuberculosis control:WHO report 2010.

[2]Sundaramurthy V,Pieters J.Interactions of pathogenic mycobacteria with host macrophages[J].Microbes Infect,2007,9(14-15):1671-1679.

[3]Fremond CM,Yeremeev V,Nicolle DM,et al.FatalMycobacterium tuberculosisinfection despite adaptive immune response in the absence of MyD88[J].J Clin Invest,2004,114(12):405-412.

[4]Pan H,Yan BS,Rojas M,et al.gene mediates innate immunity to Tuberculosis[J].Nature,2005,434(7034):767-772.

[5]李娜,朱道銀,帖儒修,等.小鼠Ipr1基因 EGFP基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建及在鼠巨噬細(xì)胞中的表達(dá)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24(3):231-233.

[6]師長宏,張海,席麗,等.結(jié)核分枝桿菌 Hsp65與IL-2融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(8):718-721.

[7]Quesniaux V,Fremond C,Jacobs M,et al.T oll-like receptor pathways in the immune responses to mycobacteria[J].Microbes Infect.2004,6(10):946-959.

[8]Zhu J,M ohan C.Toll-like receptor signaling pathways-therapeutic opportunities[J].J Immunol,2010,2010:7812-35.

[9]Feng CG,Kaviratne M,Rothfuchs AG,et al.NK cell-derived IFN-gamma differentially regulates innate resistance and neutrophil response in T cell-deficient hosts infected with Mycobacterium tuberculosis[J].J Immunol,2006,77(10):7086-7093.

[10]Arcila M L,S nchez MD,O rtiz B,et al.Activation of apoptosis,but not necrosis,duringMy cobacterium tuberculosisinfection correlated with decreased bacterial g rowth:role of TNF-alpha,IL-10,caspases and phospholipase A2[J].Cell Immunol,2007,249(2):80-93.

Immune response genes expressing of Ipr1 expressed macrophage anti-M.tuberculosis

LI Na,LIU Peng-fei,LI Bo-qing,QIAO Yuan-yuan,ZHANG Yu-mei
(Department of Pathogeny Biology of Binzhou Medical College,Yantai264003,China)

To study the effect and mechanisms of Ipr1 gene expressing in macrophages infected withMycobacterium tuberculosisH37Ra use cDNA microarry.The experimental group RAW264.7 cells were transfected with pEGFP-Ipr1 and the stable Ipr1 gene expressed RAW264.7 cells were selected by G418.The control group RAW264.7 cells were transfected with pEGFP-C1and selected by G418.Experimental group and control group cells were infected byMycobacterium tuberculosisH37Ra.After 96h infection,the total RNA were isolated from the two groups.Then using a cDNA microarry(Mouse Innate and Adaptive Immune Responses Microarray113 genes)to detect the differences of experimental group and control group in gene expression related to immune response.Real-time quantitative PCR test was used to verify the reliability of the chip results.The cDNA microarry result display that Ipr1 gene expression up regulated 11 genes for macrophage anti-Mtbinnate immunity involved TLRs signaling pathway:TLR2 and T LR4,Irak1,T raf6;as well as interferon-related genes:Ifngr1(IFN-γ R1)and tumor necrosis factor-related genes:Tnfrsf1a(TNFR1),et al.And there was no significant difference about the molecular expression involved in the regulation of the adaptive immune response such as:IL-1,IL-12.The results of real-time PCR reaction TLR2 and TLR4 and Ifngr1 indicated that the real-time PCR results consistent with the trend of chip results.The results of gene chip analysis point that the Ipr1 gene expression maybe enhance macrophage anti-Mtbinfection by the mechanisms of increasing the innate immunity gene expression,in particular TLR2/TLR4 and its signal transduction molecules as well as the IFN-γ R1,TNFR1 expression,and promote macrophage activation and intracellular anti-Mtbeffect.This constitutes the basis for further study of the mechanisms of Ipr1 gene in host innate immunity against tuberculosis infection.

Ipr1;Mycobacterium tuberculosis;macrophage

R378.91

A

1002-2694(2011)08-0715-06

*山東省高等學(xué)?？萍加媱澷Y助項目(J09LF01)

1.濱州醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,煙臺 264003;Email:bzy xy lina@163.com

2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,煙臺 264003

2011-03-09;

2011-05-21