量子點(diǎn)標(biāo)記肺炎支原體重組蛋白抗體檢測抗原方法的建立*

曾晶晶,何夢博,趙芝娜,周世冠,王桂珍

量子點(diǎn)標(biāo)記肺炎支原體重組蛋白抗體檢測抗原方法的建立*

曾晶晶,何夢博,趙芝娜,周世冠,王桂珍

目的建立一種用CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)用于肺炎支原體檢測的方法。方法用重組Mp P1蛋白免疫動(dòng)物制備免疫血清,硫酸銨沉淀法及離子層析法純化IgG抗體,純化抗體用CdSe/ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記,離心沉淀法純化標(biāo)記產(chǎn)物。用標(biāo)記抗體檢測Mp抗原。結(jié)果量子點(diǎn)標(biāo)記抗體直接玻片熒光法檢測Mp抗原具有較高的敏感性(檢測靈敏度在0.001μ g/mL),且與呼吸道常見病原菌無交叉反應(yīng)。結(jié)論成功建立量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)檢測肺炎支原體抗原方法,具有操作簡單、檢測快速的優(yōu)良,適用于M p感染的早期診斷。

肺炎支原體;量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù);抗原檢測

近年來,量子點(diǎn)憑借其自身獨(dú)特的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性越來越受到人們的重視。量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)是一種半導(dǎo)體納米晶體,與傳統(tǒng)熒光染料相比,具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、發(fā)光效率高,發(fā)光顏色可調(diào),并且具有較高的熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性,能夠承受多次的激發(fā)和光發(fā)射等一系列優(yōu)點(diǎn)[1-2],在實(shí)驗(yàn)室診斷中有著廣泛的應(yīng)用前景。

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)不僅引起急性呼吸道疾病,還引起其他多系統(tǒng)、多器官的肺外并發(fā)癥[3]。由于Mp無細(xì)胞壁,故其引起感染的治療與其它細(xì)菌和病毒感染在治療方法上有所不同。對Mp的實(shí)驗(yàn)室診斷,支原體分離培養(yǎng)雖然是金標(biāo)準(zhǔn),但其分離率低、時(shí)間長,成本高不適于臨床應(yīng)用[4]、主要是通過血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)[5]等方法,而這些方法存在著各自不同的優(yōu)缺點(diǎn),因此,到目前為止,國內(nèi)外對Mp的實(shí)驗(yàn)室診斷沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于QDs標(biāo)記技術(shù),擬探討用量子點(diǎn)標(biāo)記的重組Mp P1抗體檢測Mp抗原,建立一種新的檢測體系和方法,以期解決Mp感染的早期、快速診斷問題。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Mp FH菌株、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌和乙型鏈球菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種;P1重組蛋白為本實(shí)驗(yàn)室制備;發(fā)射波長605nm的核殼型CdSe/Zns硒化鎘量子點(diǎn),表面活性基團(tuán)為羧基,購自武漢珈源量子點(diǎn)公司;弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司;1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)均購自上海生工;熒光分光光度計(jì)(HITACHI);熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

1.2 方法

1.2.1 兔源多抗的制備 P1重組蛋白的提取與純化參照文獻(xiàn)[6],純化的重組蛋白加等體積弗氏完全佐劑免疫家兔,多點(diǎn)皮下注射免疫,以弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫3次后頸動(dòng)脈采血獲得多抗血清,以ELISA法測定抗體效價(jià)。

1.2.2 IgG的提取純化 采集的免疫血清用硫酸銨沉淀法粗提免疫球蛋白,取免疫血清加入飽和(NH4)2SO4使其成20%溶液,以除去纖維蛋白。吸取離心上清加入飽和(NH4)2SO4使之成為50%溶液以除去白蛋白,再加入飽和(NH4)2SO4使其成33%溶液從而除去類球蛋白,沉淀溶于PBS中即為粗提Mp多克隆抗體。取NaOH處理后的DEAESephadex A-50裝柱,用0.01 mol/L PBS平衡至pH7.4后加入硫酸銨粗提免疫球蛋白,然后用洗脫液進(jìn)行洗脫并分管收集,用紫外分光光度計(jì)測純化抗體的濃度。采用SDS-PAGE方法確定抗體純度。

1.2.3 抗體標(biāo)記與純化[7]在1.5mL的微量離心管中加入50μ L的量子點(diǎn)(8.05μ mol/L),然后加入10μ LEDC(0.4mg)和 10 μ L sulfo-NHS(0.2mg),加磷酸鹽緩沖液補(bǔ)至800μ L,不停地混合溶液,室溫下反應(yīng)20min。加入純化的抗體 200 μ L(5 mg/mL),37℃振蕩反應(yīng)2 h。加入100 μ L甘氨酸(1 mol/L),封閉量子點(diǎn)上未反應(yīng)的羧基。將偶聯(lián)反應(yīng)所得到的產(chǎn)物4℃,12 000 r/min離心20 min,所得沉淀即為純化的偶聯(lián)有量子點(diǎn)的P1重組蛋白抗體。

1.2.4 量子點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)物效果測定 偶聯(lián)產(chǎn)物熒光效率測定:用熒光分光光度計(jì)測定量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體,通過標(biāo)記物熒光強(qiáng)度的測定,判定抗體-量子點(diǎn)的偶聯(lián)反應(yīng)是否改變量子點(diǎn)的熒光效率。試驗(yàn)所用激發(fā)光為488 nm,掃描605 nm的發(fā)射波譜。

偶聯(lián)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性測定 取Mp全菌抗原2μ L滴于硝酸纖維素膜(NC膜)上,4℃干燥后用BSA-PBS 4℃封閉過夜。用PBS洗膜 3次,干燥后,在含有包被抗原處分別加入量子點(diǎn)偶聯(lián)-P1重組蛋白抗體、量子點(diǎn)、P1重組蛋白抗體和PBS反應(yīng)。37℃作用2 h,反應(yīng)后用PBS洗3次,在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.5 量子點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)物檢測Mp抗原 取Mp FH對數(shù)生長期培養(yǎng)物,12 000 r/min離心30min,棄上清,沉淀加入0.01 mol/L的PBS溶液,充分混勻,離心洗滌3次,收集沉淀反復(fù)凍融3次后,即為Mp菌體抗原,加入0.01 mol/L的PBS制備菌懸液,取5μ L菌懸液滴加于玻片上,室溫自然干燥,用-20℃預(yù)冷的丙酮固定。將1∶40稀釋的偶聯(lián)有P1重組蛋白多克隆抗體的量子點(diǎn)(0.4μ mol/L)滴加入上述抗原片上,于37℃濕盒中作用45 min,用 PBS洗滌3次,自然干燥,滴加堿性緩沖甘油,加蓋玻片封片,在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 將Mp菌體抗原依次稀釋為10 μ g/mL 、1 μ g/mL 、0.1 μ g/mL 、0.01 μ g/mL 、0.001 μ g/mL,固定其它條件,操作過程同 1.2.5,以PBS作空白對照進(jìn)行檢測。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌抗原按1.2.5操作,以PBS作空白對照進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 Mp P1重組蛋白免疫血清純化 ELISA方法測定P1免疫血清效價(jià)為1∶25 600,蛋白濃度為18.1 mg/mL,用飽和硫酸銨沉淀法后測得蛋白濃度為8.471 mg/mL,DEAE-Sephadex A-50離子交換層析法進(jìn)行純化后的P1重組蛋白IgG濃度為3.68 9mg/mL。SDS-PAGE結(jié)果顯示見圖1,粗制免疫血清中含有多種蛋白組分,飽和硫酸銨沉淀純化的抗體仍有雜蛋白,而經(jīng)過離子層析純化后的血清僅有1條帶,分子量為57kD與IgG重鏈分子量相符。

圖1 SDS-PAGE鑒定Mark:分子量標(biāo)準(zhǔn);1:P1重組蛋白免疫血清;2:P1重組蛋白硫酸銨沉淀免疫血清;3:P1重組蛋白離子交換層析方法純化的血清Fig.1 Analysis of purified Mp IgG by SDS-PAGE

2.2 量子點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)物效果測定結(jié)果:用Hitachi F-4500分光光度計(jì)選擇488nm激發(fā)波長測定標(biāo)記產(chǎn)物。結(jié)果顯示,抗體與量子點(diǎn)的偶聯(lián)反應(yīng)未改變量子點(diǎn)的發(fā)射波長的熒光效率。

偶聯(lián)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性測定結(jié)果顯示,膜上滴加偶聯(lián)有量子點(diǎn)的P1重組蛋白抗體顯示較強(qiáng)的紅色熒光,而滴加量子點(diǎn)、P1重組蛋白抗體和PBS對照的位置無紅色熒光,如圖3。證明本實(shí)驗(yàn)成功將量子點(diǎn)標(biāo)記在P1重組蛋白抗體上,且被標(biāo)記的P1重組蛋白抗體仍能與相應(yīng)抗原分子特異性結(jié)合。

2.3 量子點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)物檢測Mp抗原 含有有Mp菌體抗原部分呈現(xiàn)出橘黃色、邊界清晰的圓形顆粒,見圖4。隨著MP抗原濃度減少,出現(xiàn)的熒光點(diǎn)也隨之減少,其可以檢測到 0.01μ g/ml～0.001μ g/mL MP蛋白中的抗原,見圖5,表明有較高的敏感性。將標(biāo)記抗體分別與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌抗原作用,由圖6所示,結(jié)果表明特異性較好。

圖4 ×1 000Fig.4 MP抗體顆粒

3 討 論

近十多年來,量子點(diǎn)熒光標(biāo)記技術(shù)陸續(xù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中使用。早期研究主要集中于對細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記成像。由于其具有高靈敏度、靶向、實(shí)時(shí)、原位、活體、多色、多功能示蹤等特性,近來被應(yīng)用于病原學(xué)檢測及致病機(jī)制研究[8-9]。將量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)用于病原抗體檢測[10]及抗原檢測[11-12]的研究均有報(bào)道,結(jié)果顯示量子點(diǎn)偶聯(lián)抗體有較大的應(yīng)用潛力,在實(shí)驗(yàn)室診斷領(lǐng)域中也受到了人們廣泛的關(guān)注。

Mp感染廣泛存在于世界各地,可引起地區(qū)性流行。早期診斷、早期治療可明顯縮短Mp感染病程,建立有效、敏感的早期檢測方法是十分重要的。

本文利用交聯(lián)劑DEC和NHS,采用共價(jià)鍵連接的方法進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記。EDC和量子點(diǎn)表面的羧基反應(yīng)生成酰基異脲,但?；愲逶谒芤褐腥菀姿?又生成羧基產(chǎn)物。在溶液中加入NHS,酰基異脲極易和NHS反應(yīng),生成具有胺反應(yīng)活性的NHS酯,其能與抗體表面的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺而偶聯(lián)到抗體上。與傳統(tǒng)的抗體熒光素標(biāo)記方法相比,量子點(diǎn)標(biāo)記方法十分簡單,只需要簡單離心就可對標(biāo)記產(chǎn)物純化。而傳統(tǒng)的抗體熒光素標(biāo)記方法需要反應(yīng)過夜,標(biāo)記產(chǎn)物還需要透析法或?qū)游龇ㄟM(jìn)行純化,整個(gè)過程耗時(shí),且操作繁瑣。

本文應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記P1重組蛋白抗體用于Mp抗原的檢測,由于重組蛋白特異性高[7],本研究用其抗體以直接免疫熒光法檢測Mp抗原也顯示出高的特異性,與其他呼吸道常見菌無交叉反應(yīng)。在預(yù)先完成量子點(diǎn)標(biāo)記后,從處理標(biāo)本到完成目標(biāo)抗原檢測,用該方法檢測所需時(shí)間為45～60min,對Mp蛋白抗原檢測的靈敏度在0.001 μ g/mL,表明方法簡便、快速、敏感。由于感染后抗原出現(xiàn)時(shí)間早于抗體,因此可用于Mp感染的早期診斷。

本研究應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)建立的Mp抗原檢測方法,已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)階段取得了比較理想的結(jié)果,不僅具有較高的靈敏度和很好的特異性,操作也更加簡便快速。本實(shí)驗(yàn)組將會(huì)對該檢測體系和方法在臨床標(biāo)本檢測中應(yīng)用作進(jìn)一步的研究和評價(jià)。

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Detection ofMycoplasma pneumoniaeby quantum dots label antibody

ZENG Jing-jing,HE Meng-bo,ZHAO Zhi-na,ZHOU Shi-guan,WANG Gui-zhen
(Departmentof Pathogenic biology,College of basic medical science,Chinamedical universtity,Shenyang110001,China)

A test method using quantum dots conjugation was developed for the detection ofM.pneumoniae.To obtain the anti-M p P1 polyclonal antibody,a rabbit was immunized with recombinantMpP1 antigens.The polyclonal antiserum was purified by ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.CdSe/ZnS quantum dots(QDs)was used to label rabit anti-recombinant P1 protein IgG,and the production was purified.M.pneumoniaewas successfully detected at the concentration as low as 0.001 g/mL.No crossreaction was observed when this system was used to detectM.pneumoniaeand other common bacteria.The QDs test method established in this study had been demonstrated to be a specific,sensitive and rapid for the diagnosis of mycoplasma,and it offers a promising possibility to be used in laboratory diagnosis.

M.pneumoniae;quantum dots;antigen detection

R374

A

1002-2694(2011)08-0704-04

*遼寧省教育廳基金項(xiàng)目(No.2004D226)資助

王桂珍,Email:gzw004@126.com

中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,沈陽110001

2011-01-17;

2011-03-24