大鼠腎移植慢性排斥反應(yīng)模型的建立

賈其磊，尚攀峰，侯子珍，郗新生，岳中瑾

(1.攀枝花市第二人民醫(yī)院泌尿外科，攀枝花 617068;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，蘭州 730030)

大鼠腎移植慢性排斥反應(yīng)模型的建立

賈其磊1，尚攀峰2，侯子珍2，郗新生2，岳中瑾2

(1.攀枝花市第二人民醫(yī)院泌尿外科，攀枝花 617068;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，蘭州 730030)

目的 建立一種穩(wěn)定的大鼠原位腎移植慢性排斥反應(yīng)模型。方法 供體為近交系F344大鼠，受體為L(zhǎng)ewis大鼠，供腎采用左腎，在體修整，原位灌注。腎靜脈用硬膜外導(dǎo)管做為臨時(shí)內(nèi)支架管端-端、六針法吻合，腹主動(dòng)脈端-側(cè)連續(xù)縫合，輸尿管帶膀胱瓣與膀胱吻合。受體術(shù)前3 d開始環(huán)孢素A灌胃至術(shù)后30 d(5 mg/kg·d)，以預(yù)防急性排斥反應(yīng)。結(jié)果 手術(shù)時(shí)間120～180 min;手術(shù)成功率90.9%(40P44);受體均存活60 d。并發(fā)癥有吻合口出血、靜脈血栓形成、急性排斥反應(yīng)等。結(jié)論 供腎原位灌注，在體修整是簡(jiǎn)單可靠的方法。靜脈內(nèi)支架管端端吻合，腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合能夠達(dá)到穩(wěn)定的成功率，值得推廣。熟練的外科操作技能和血管吻合技術(shù)是手術(shù)成功的關(guān)鍵。

腎移植;大鼠;模型，動(dòng)物;慢性排斥反應(yīng)

1 材料和方法

1.1 材料

普通級(jí)健康雄性近交系F344和Lewis大鼠作為供體和受體，購(gòu)于蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK(軍 2002～026)］，12～16周齡，體重250～300 g。顯微外科手術(shù)器械。HC～A離體腎保存液(上海長(zhǎng)征醫(yī)院)、0.8%硫噴妥鈉、肝素鈉(天津生物化學(xué)制藥廠)、等滲鹽水、青霉素鈉(華北制藥廠)。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備和麻醉：供、受體術(shù)前6 h禁食，不禁水，受體術(shù)前3 d和術(shù)晨用環(huán)孢素A 5 mg/kg灌胃。0.8%硫噴妥鈉1.25 mL/100 g腹腔注射麻醉.麻醉成功后取仰臥位，術(shù)野備皮，碘伏消毒局部皮膚，鋪無(wú)菌巾單。

1.2.2 供體手術(shù)：腹正中旁左側(cè)1.0 cm縱行切口，長(zhǎng)約3.0 cm。切開皮膚和皮下組織，肌層和腹膜切開一小口，沿肌纖維方向鈍性分離至切口大小。推開腹腔內(nèi)容物顯露左腎，切開后腹膜，于腎靜脈下方向下游離并保護(hù)左輸尿管。沿后腹膜下鈍性分離顯露左腎動(dòng)、靜脈近側(cè)端;5/0細(xì)絲線結(jié)扎腎上腺靜脈。游離腹主動(dòng)脈和下腔靜脈至腰靜脈起始處;除去血管周圍脂肪和結(jié)締組織，依次結(jié)扎(3/0絲線)腸系膜上動(dòng)脈、右腎動(dòng)脈和腹腔干，分離、結(jié)扎下腔靜脈及腹主動(dòng)脈通向腰背部的血管。下腔靜脈貼肝臟下緣處及腹主動(dòng)脈和下腔靜脈遠(yuǎn)側(cè)端擬切斷處各留置一根0號(hào)絲線，先結(jié)扎腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)側(cè)端，在腹主動(dòng)脈貼主動(dòng)脈裂孔處結(jié)扎腹主動(dòng)脈近側(cè)端、下方剪斷、立即從近心端插入一直徑1.0 mm的硬膜外麻醉導(dǎo)管，注入0～4℃、HC～A液2 mL后腎臟變白，至腎靜脈流出液清亮為止，停止灌注。腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)側(cè)結(jié)扎處剪斷，在腎靜脈近端與下腔靜脈匯合處切斷腎靜脈，游離腎臟。游離輸尿管至膀胱，游離膀胱周圍組織，尿道根部切斷，整塊將左側(cè)腎臟及腎靜脈和腹主動(dòng)脈、輸尿管、膀胱取下，放入帶冰的器官保存液中。

1.2.3 供腎體外處理：橫斷膀胱，以左輸尿管開口為中心，剪一直徑3 mm大小的膀胱瓣;將一硬膜外麻醉導(dǎo)管長(zhǎng)約1.0 cm插入左腎靜脈，紗布包裹腎臟，腎血管原位保留，外置冰屑，冷存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 受體手術(shù)：腹左側(cè)切口長(zhǎng)約3.0 cm，如前法游離左腎及其動(dòng)、靜脈至腎門處，離斷左側(cè)輸尿管，結(jié)扎左腎動(dòng)脈，斷端雙重結(jié)扎，血管外脂肪和結(jié)締組織剔除干凈;用Lee氏夾貼下腔靜脈處夾住腎靜脈，在腎門處切斷，去除左腎并把供腎置原腎臟位置;經(jīng)陰莖背靜脈注入含肝素鈉50 U/mL的生理鹽水3 mL。先吻合靜脈，后吻合動(dòng)脈。供腎靜脈內(nèi)置入硬膜外導(dǎo)管長(zhǎng)約1.0 cm做為內(nèi)支架管，內(nèi)支架管另一頭插入受體左腎靜脈。腎上腺靜脈殘端做為標(biāo)記對(duì)應(yīng)整齊，防止扭曲;術(shù)者在10倍手術(shù)顯微鏡下縫合，助手在直視下配合并打結(jié)。用10/0無(wú)損傷縫合線在靜脈兩端各縫合1針作為牽引，先縫合后側(cè)壁，然后前壁間斷縫合各兩針，共6針;最后一針打結(jié)前拔出內(nèi)支架管。然后吻合動(dòng)脈，在受鼠腹主動(dòng)脈預(yù)留吻合口處上下各夾一動(dòng)脈夾，動(dòng)脈壁剪一小口約相當(dāng)于動(dòng)脈內(nèi)徑大小，肝素鹽水沖洗管腔。采用連續(xù)縫合每側(cè)8～10針，吻合完畢。只要縫針均勻，一般不會(huì)出血。用8/0無(wú)損傷縫合線縫扎供腎腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端開口。去除腎臟周圍的冰屑，開放腎血流，數(shù)秒內(nèi)可見移植腎實(shí)質(zhì)變鮮紅、均勻、腎靜脈充盈、吻合口飽滿、腎動(dòng)脈搏動(dòng)有力，5 min左右可見輸尿管膀胱開口處有尿液流出。吻合口出血用棉球輕壓片刻，一般均能停止。將腎臟置于原位妥善固定。輸尿管膀胱瓣和受體膀胱端～側(cè)吻合，用6/0無(wú)損傷縫合線連續(xù)全層縫合，輸尿管防止扭曲。在腹腔內(nèi)留置青霉素鈉5萬(wàn) U和生理鹽水5 mL，逐層關(guān)腹。術(shù)后用燈箱保溫約30 min，麻醉清醒后飼以葡萄糖生理鹽水，恢復(fù)行走后放回籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。術(shù)后5 d待大鼠一般狀況恢復(fù)后，將其背部絲線拉緊打結(jié)替代腎切除，結(jié)扎后3 d剪斷結(jié)扎線，使線端縮入體內(nèi)。如為了觀察移植后局部免疫病理變化，可不切除右腎。術(shù)后5 mg/kg·d灌胃直至術(shù)后30 d，再飼養(yǎng)至術(shù)后60 d處死，取靜脈血2 mL待用，切取移植腎做病檢。

2 結(jié)果

在經(jīng)4個(gè)月80多次訓(xùn)練，我們較為熟練地掌握了大鼠腎移植顯微外科技術(shù);在試驗(yàn)階段共實(shí)施移植手術(shù)44例(F344大鼠44只，Lewis大鼠44只)，供體手術(shù)時(shí)間約35～50 min，受體手術(shù)約90～120 min，取腎和植腎總手術(shù)時(shí)間120～180 min，熱缺血時(shí)間＜15 s，冷缺血時(shí)間20～40 min，靜脈吻合時(shí)間10～15 min，動(dòng)脈吻合時(shí)間15～25 min;再通血流后，腎臟立即充盈轉(zhuǎn)為鮮紅色，腎動(dòng)脈可觸及搏動(dòng)。3例吻合口漏血，2例加針后出血停止，1例動(dòng)脈吻合口出血致術(shù)中死亡。手術(shù)后，受體大鼠30min左右清醒，當(dāng)天能進(jìn)食。術(shù)后兩個(gè)月成活40只，成活率90.9%(40/44)，術(shù)后存活均能達(dá)60 d。術(shù)后4 h死亡1例和20 h死亡各1例，尸體解剖證實(shí)為動(dòng)脈血栓形成，術(shù)后3 d死亡1例為靜脈血栓形成。

60 d切取移植腎做病檢，移植腎體積較正常腎臟明顯增大，質(zhì)地變硬，表面有細(xì)顆粒狀改變;鏡下明顯的移植腎間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)顯著，腎小球和血管周邊間質(zhì)炎性反應(yīng)和纖維化改變，腎小球基底膜增厚，并伴有腎小管的變性和壞死，血管內(nèi)膜炎性增生(彩插1圖1)。依據(jù) Banff 97標(biāo)準(zhǔn)，符合慢性排斥反應(yīng)改變。

3 討論

建立穩(wěn)定的動(dòng)物腎移植模型是研究腎移植的基礎(chǔ)，大鼠模型具有其它動(dòng)物模型無(wú)法達(dá)到的動(dòng)物品系的穩(wěn)定性。我們?cè)谇叭说幕A(chǔ)上不斷探索，在試驗(yàn)方法上進(jìn)行了一些改進(jìn)并取得了一些經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)如下：

3.1 動(dòng)物選擇

理想的慢性排斥反應(yīng)模型理論上應(yīng)該是僅存在慢性排斥反應(yīng)而無(wú)急性排斥反應(yīng)，F(xiàn)344和Lewis大鼠在MHCI和MHCI1分子方面完全相同.僅在非MHC分子方面有差別。因此，F(xiàn)344和Lewis大鼠之間器官移植應(yīng)該是誘導(dǎo)慢性排斥反應(yīng)模型的理想動(dòng)物，成為國(guó)際上公認(rèn)的慢性排斥反應(yīng)模型。在此基礎(chǔ)上，本研究術(shù)前3 d給予5 mg/kg環(huán)孢素A灌胃直至術(shù)后第30天作為基礎(chǔ)抗排斥治療。實(shí)驗(yàn)表明，所有的受體均存活超過(guò)60 d，所有受體可見慢性炎細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管變性、壞死等典型的慢性排斥反應(yīng)改變，證明慢性排斥反應(yīng)模型的建立是成功的。

3.2 手術(shù)方式

供腎手術(shù)采用在體修整，原位灌注的方法，熱缺血時(shí)間明顯較短，而且便于修整。熱缺血時(shí)間≤15 s，相對(duì)于離體灌注具有明顯優(yōu)勢(shì);自從 Fisher［1］提出了腎動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈，腔靜脈端-側(cè)吻合，對(duì)受體雖有一定的生理干擾，但目前仍然是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。Grau［2］等采用腎血管端-端吻合，不影響全身的血液循環(huán)，但血管吻合技術(shù)要求高，吻合難度大，要具備相當(dāng)?shù)娘@微外科設(shè)備和技術(shù)，而且，形成血栓或狹窄的機(jī)率很高。有學(xué)者提出袖套法吻合確實(shí)是一種較為簡(jiǎn)單的操作方法，但Schumacher等［3］分析眾多資料后認(rèn)為：端-端或端-側(cè)血管吻合效果優(yōu)于袖式技術(shù)。我們?cè)谠囼?yàn)當(dāng)中也發(fā)現(xiàn)袖套法的通暢率不如端-側(cè)，而且，整個(gè)操作過(guò)程要在水中進(jìn)行。否則，易形成空氣栓塞。因此，我們?nèi)匀贿x擇了靜脈端-端吻合，動(dòng)脈端-側(cè)吻合的手術(shù)方式。雙側(cè)供腎的移植術(shù)節(jié)約了大鼠，但動(dòng)脈必須要采用端-端吻合，增加了吻合難度，反而降低總成功率。靜脈吻合我們使用內(nèi)支架管，右腎靜脈太短，不易放置支架管。因此，我們?nèi)」┦笞髠?cè)腎臟為供腎。國(guó)際上一般多采用左側(cè)原位移植，因左側(cè)血管條件好，操作方便，易于掌握，節(jié)省時(shí)間，并發(fā)癥少［4］。

3.3 切口選擇

切口選擇是我們的一個(gè)改進(jìn)，以往的報(bào)導(dǎo)均作腹部正中或十字切口，上及劍突，下至恥骨聯(lián)合。這種切口通常需將腸管裹至體外，而且暴露并不好，主要的血管吻合等操作均需在深部進(jìn)行。我們選擇左側(cè)旁正中切口，切開皮膚后，肌層切開一小口，沿肌纖維方向鈍性分離肌層和腹膜。我們觀察到;此切口明顯較短，僅3.0 cm，出血少，暴露好，損傷較小，減少體液丟失及腸管損傷，不必將腹壁和腸管翻出體外即可獲得充分暴露。

3.4 血管吻合

血管吻合技術(shù)是建立模型成功的關(guān)鍵，需要至少一個(gè)月以上練習(xí)。六針法和硬膜外支架管內(nèi)支撐法吻合靜脈是我們的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。腎靜脈和腎靜脈端-端吻合，腹主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈端-側(cè)吻合。靜脈的縫合最常出現(xiàn)的并發(fā)癥是狹窄，靜脈壁很薄也給吻合增加了難度。容易扭曲或縫至對(duì)側(cè)，或邊距太大致吻合口狹窄。我們選用10/0無(wú)損傷縫合線，內(nèi)置硬膜外導(dǎo)管作為臨時(shí)支架管，克服了縫至對(duì)側(cè)壁的可能。結(jié)扎腎上腺靜脈均用5/0絲線，并以此作為對(duì)端之標(biāo)記，以防止扭曲。只要邊距適當(dāng)，針距均勻，無(wú)張力下開通血流，一般無(wú)需加針。若有出血，一般用棉球輕壓片刻即可。靜脈吻合時(shí)間10～15 min，動(dòng)脈吻合時(shí)間15～25 min;在吻合靜脈時(shí)，并不阻斷腔靜脈的血流，因此下肢不會(huì)發(fā)生回流受阻現(xiàn)象，有利于大鼠的恢復(fù)，且不會(huì)引起血栓［5］。血管吻合主要的難度是動(dòng)脈，小動(dòng)脈吻合是采用連續(xù)或間斷縫合一直有爭(zhēng)議［6］。本實(shí)驗(yàn)中采用連續(xù)縫合，不容易狹窄或漏血，動(dòng)脈吻合成功率90.9%(41/44)。通過(guò)熟練練習(xí)以后，一般均能獲得成功。本組3例吻合口漏血，2例加針后出血停止，1例動(dòng)脈吻合口出血致術(shù)中死亡。要保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)膜，術(shù)中禁止鉗夾動(dòng)脈內(nèi)膜，吻合時(shí)盡可能使吻合口內(nèi)膜化，從而降低動(dòng)脈血栓形成機(jī)率［7］。

3.5 動(dòng)物選擇原則

(1)熟練的手術(shù)操作;需要具備有一定的外科操作技能，解剖清晰，以迅速流暢的完成手術(shù)。盡可能減少循環(huán)阻斷時(shí)間和手術(shù)時(shí)間，以利于術(shù)后恢復(fù)［6］;(2)術(shù)中要嚴(yán)防出血，最重要的是盡可能減少或避免受體血管游離及吻合過(guò)程中的失血。一些對(duì)人看來(lái)很少的出血，對(duì)大鼠可能是致命的。(3)術(shù)中適當(dāng)補(bǔ)液，可以在切除受鼠左腎之前從陰莖背靜脈注入肝素生理鹽水2～3 mL以補(bǔ)充血容量。(4)注意保持傷口的濕化，減少體液的喪失，以便使術(shù)后大鼠能夠盡快恢復(fù)。切除受體左側(cè)腎臟時(shí)，應(yīng)先結(jié)扎腎動(dòng)脈，稍后貼近腎臟結(jié)扎腎靜脈，盡可能減少失血量;(5)在體修整和原位灌注縮短了熱缺血時(shí)間，熱缺血時(shí)間一般均＜15 s，減少了缺血-再灌注損傷。(6)機(jī)體溫度的保持和恢復(fù)、良好的麻醉，術(shù)中腎周冰塊不斷融化流入腹腔，使內(nèi)臟溫度驟然降低，造成低溫。全身麻醉后，肌肉戰(zhàn)栗這一防御反應(yīng)消失，雖然低溫在心臟或腦缺氧狀況下具有器官保護(hù)作用，但圍手術(shù)期低溫的不利影響不容忽視。刺激周圍血管收縮，增加循環(huán)阻力，造成組織缺氧，還能顯著影響凝血機(jī)制，導(dǎo)致凝血機(jī)能障礙。［8］

3.6 圍手術(shù)期的處理

成功的手術(shù)還需要良好的圍手術(shù)期處理;注意大鼠整體機(jī)能的恢復(fù)，術(shù)后應(yīng)迅速用燈箱盡快復(fù)溫。嚴(yán)格意義上急性排斥反應(yīng)得到很好的控制以后出現(xiàn)的排斥現(xiàn)象才是慢性排斥反應(yīng)。術(shù)前三d開始至術(shù)后30 d用環(huán)孢素A灌胃較好的抑制了急性排斥反應(yīng)，使大鼠的存活時(shí)間達(dá)到了試驗(yàn)的要求。我們?cè)陬A(yù)試驗(yàn)過(guò)程中，部分受體大鼠雖然血管吻合成功，但大鼠最終死于圍手術(shù)期，分析可能是手術(shù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，體液、體溫的急劇變化超出大鼠的耐受能力所致。反過(guò)來(lái)，順利度過(guò)圍手術(shù)期的大鼠，一般均能存活超過(guò)60 d。后來(lái)，通過(guò)加快手術(shù)速度，術(shù)中術(shù)后注意保溫及補(bǔ)液等措施后，死亡率明顯下降。丹麥學(xué)者 kehlet［8］提出 fast track surgery，即采用一系列措施減少圍手術(shù)期的應(yīng)激反應(yīng)，減少創(chuàng)傷，促進(jìn)康復(fù)也是很重要的。我們將這一原則應(yīng)用于大鼠，效果明顯。

4 結(jié)論

供腎在體修整，原位灌注取腎是可靠的方法。熟練的外科操作技能和血管吻合技術(shù)是手術(shù)成功的關(guān)鍵。靜脈內(nèi)支架管端端吻合，腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合能夠達(dá)到試驗(yàn)要求，值得推廣。

［1］ Fisher B，Lee S， Kutz K， etal. Microvascularsurgical technique in research with special reference to renal transplantation in the rat［J］.Surgery，1965，58：9041.

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Establishment of Rat Chronic Renal Transplantation Allograft Rejection Model

JIA Qi-lei1，SHANG Pan-feng2，HOU Zi-zhen2，XI Xin-sheng2;YUE Zhong-jin2
(1.Department of Urology，Second Hospital of Panzhihua，Panzhihua 617068，China;2.Department of Urology，Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China)

Objective To explore establishment a stable model of rat chronic renal allograft rejection.Methods Inbred F344 and Lewis rats were used as the donors and the recipients.Used the left kidney as a donor kidney，dressing for the kidney in vivo and in situ perfusion.Epidural catheter within the renal vein as a temporary stent tube，end-to-end of the six acupuncture anastomosis.Artery end-to-side continuous suture;ureter and bladder with the bladder flap anastomosis，Used cyclosporine A 5 mg/kg·d to 30 days after operation to prevent acute rejection from three days before operation.Results The total time of operation about 120～180 min，success rate about 90.9%(40P44);receptors can survive up to 60 d.the complications include anastomotic bleeding，venous thrombosis and acute rejection etc.Conclusion Dressing for kidney in vivo and in situ from renal perfusion is a simple and reliable method.Stent vein of end-to-end anastomosis，abdominal aortic end-to-side anastomosis can be achieved stable rate of success is worth promoting.Skilled surgical and vascular anastomosis operation is the key to success.

Renal transplantation;Rats;Model，animal;Chronic rejection

R699.2 R332

A

1671-7856(2011)03-0018-04

2010-07-20

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.005

賈其磊(1976-)，男，碩士，主治醫(yī)師，四川省攀枝花市第二人民醫(yī)院泌尿外科。

岳中瑾，主任醫(yī)師、教授、博士生導(dǎo)師，研究方向：腎移植。E-mail：yuezhongjin@sina.com。