導(dǎo)管體外端保護裝置在大鼠長期腰蛛網(wǎng)膜下腔置管模型中的應(yīng)用

杜世偉，包新杰，馮 銘，魏俊吉，郭 旭，王任直

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100730)

導(dǎo)管體外端保護裝置在大鼠長期腰蛛網(wǎng)膜下腔置管模型中的應(yīng)用

杜世偉，包新杰，馮 銘，魏俊吉，郭 旭，王任直

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100730)

目的 設(shè)計一種大鼠長期腰蛛網(wǎng)膜下腔置管模型中微導(dǎo)管體外端的保護裝置，并證明其有效性。方法24只清潔級SD大鼠分為對照組(n=12)和應(yīng)用裝置組(n=12)，術(shù)前1 d和術(shù)后第1、3、7天行轉(zhuǎn)棒和熱水甩尾試驗，檢查置入裝置對大鼠運動及感覺神經(jīng)功能影響情況。計數(shù)術(shù)后大鼠導(dǎo)管保留情況，利多卡因試驗證實導(dǎo)管性能。結(jié)果 本次試驗兩組大鼠術(shù)后均無死亡及明顯癱瘓情況;術(shù)前及術(shù)后1，3，7 d轉(zhuǎn)棒實驗及熱水甩尾實驗均未見兩組明顯差異(P＞0.05，獨立樣本T檢驗，);對照組體外導(dǎo)管末端在術(shù)后幾天內(nèi)被損毀或拔出無法進行進一步實驗，術(shù)后第7天應(yīng)用裝置組所有導(dǎo)管末端仍保持完整，利多卡因?qū)嶒烇@示導(dǎo)管功能良好(P＞0.05，χ2檢驗)。結(jié)論 該裝置可有效保護置入大鼠腰蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管的體外端，非常適用于需要長期反復(fù)腰蛛網(wǎng)膜下腔注射的研究。

保護裝置;蛛網(wǎng)膜下腔置管;大鼠

大鼠蛛網(wǎng)膜下腔長期置管模型是由Yaksh和Rudy在1976年發(fā)明，隨后被廣泛應(yīng)用于麻醉、鎮(zhèn)痛以及神經(jīng)科學等研究領(lǐng)域［1］。但隨著這一經(jīng)典模型的流行，它的一些缺點也逐漸顯露出來，置管后體外段的保留問題就是其中之一。報道發(fā)現(xiàn)在置管后幾天內(nèi)，50%的置管體外段都會被大鼠毀壞而造成模型無法使用，而且每次注藥都需要切斷導(dǎo)管末端，注藥后需要重新加熱封閉導(dǎo)管末端，不但增加了操作的復(fù)雜性，也增加感染可能［1～3］。為了解決這一問題，我們設(shè)計并制作了置入大鼠皮下的導(dǎo)管末端保護裝置，解決了大鼠腰蛛網(wǎng)膜下腔置管后導(dǎo)管末端保留問題并且簡化了反復(fù)注藥操作，介紹如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

清潔級SD大鼠，雄性，250～300g，由中國人民解放軍軍事科學院提供［SCXK(0014281)］;蛛網(wǎng)膜下腔引流管(外徑 1.0 mm，內(nèi)徑 0.5 mm，BD Perisafe，蘇州，中國);聚乙烯輸注管(外徑 2.0 mm，內(nèi)徑1.0 mm，BAYER，F(xiàn)resenius Kabi，德國);1mL 注射器(BD，Becton Dickinson，新加坡);2%利多卡因注射液(國產(chǎn));DXP-2大小鼠轉(zhuǎn)棒儀(中國醫(yī)學科學院藥物研究所);體式顯微鏡及顯微手術(shù)器材(國產(chǎn))。

1.2 大鼠腰蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管及末端保護裝置的制作

本實驗采用改造的人腰蛛網(wǎng)膜下腔引流管作為大鼠腰蛛網(wǎng)膜下腔導(dǎo)管。切取一段引流管，將其一端置入沸水中拉長，使其外徑降至0.35 mm左右，作為蛛網(wǎng)膜下腔置入端。纖細的置入段可以降低置管過程中導(dǎo)管對脊髓的損傷［2，4］。修整導(dǎo)管長度，帶有末端保護裝置的導(dǎo)管保留總長度為5.5 cm，其中拉長段約3 cm。而沒有末端保護裝置的導(dǎo)管總長度需要15 cm左右，同樣保留拉長段約3 cm。末端保護裝置分為兩部分，穿刺囊和連接管，穿刺囊是取自1 mL注射器的橡膠塞，筒狀，內(nèi)徑2.0 mm，長度5.0 mm，經(jīng)試驗其底面可以反復(fù)穿刺而不出現(xiàn)液體滲漏。連接管長1 cm，切取自聚乙烯輸注管，其內(nèi)徑與外徑恰好與導(dǎo)管和穿刺囊匹配。將連接管一端插入穿刺囊底部，另一端與導(dǎo)管未拉伸端連接。連接管可以緊密的將導(dǎo)管和穿刺囊連接起來，形成一整體，必要時可使用樹脂膠進行加固，結(jié)構(gòu)如圖1。所有置入裝置置入前均進行滅菌消毒。

1.3 手術(shù)過程

健康雄性清潔級SD大鼠24只，隨機分為對照組(n=12)和應(yīng)用裝置組(n=12)。所有大鼠采用腹腔注射10%水合氯醛(0.3～0.4 mL/100 g)麻醉。麻醉顯效后，大鼠俯臥位，腹下墊20 mL注射器針筒以擴大棘突間隙，L5-6處去毛消毒后采用正中直切口切開皮膚，顯微鏡下分離椎旁肌肉至椎板，清除L5-6椎間隙間韌帶直至硬膜外，24G針頭挑開硬脊膜，可見腦脊液滲出。改進的置入裝置內(nèi)充滿無菌生理鹽水，將拉長段小心的向頭端方向置入蛛網(wǎng)膜下腔約3 cm，3-0無菌帶針絲線將導(dǎo)管固定于L5棘突或椎旁肌肉、筋膜上，縫合椎旁肌肉及背部筋膜。穿刺囊置于皮下椎旁，穿刺底面朝向尾端，固定于背部筋膜之上，縫合背部皮膚(圖2)。對照組采用目前較多采用的導(dǎo)管末端保留方法，置入導(dǎo)管及固定后，導(dǎo)管末端在皮下潛行至大鼠枕部兩耳之間穿出皮膚固定，體外保留2～3 cm長度，10 μL無菌生理鹽水沖洗導(dǎo)管后，加熱封閉末端。所有大鼠術(shù)后返回鼠籠，自然蘇醒。

圖1 置入導(dǎo)管及保護裝置組裝后實物Fig.1 Schematic illustration of construction of the device

圖2 導(dǎo)管及保護裝置最終置入示意圖Fig.2 Graphic illustration of the final procedure for implantation of the device.

1.4 神經(jīng)功能評價

術(shù)前1 d及術(shù)后第1、3、7天檢測兩組大鼠運動及感覺神經(jīng)功能情況。運動功能檢測采用轉(zhuǎn)棒實驗，術(shù)前所有大鼠均接受3 d常規(guī)轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練，每天測試3次，每次間隔2 h。轉(zhuǎn)棒儀起始設(shè)定為4 roll/min，待大鼠行走平穩(wěn)后將轉(zhuǎn)速在5 min內(nèi)逐步增至40 roll/min，并保持轉(zhuǎn)速不變，記錄轉(zhuǎn)棒開始加速至大鼠落下時間，最長時限設(shè)為300 s。熱水甩尾實驗檢測感覺功能。將大鼠尾尖5 cm浸入55℃的恒溫熱水中，記錄鼠尾甩出水面時間，最長時間為15 s，結(jié)果取三次測量的平均值，測量間隔時間3 min。

1.5 導(dǎo)管性能檢測

導(dǎo)管置入腰蛛網(wǎng)膜下腔以后，在術(shù)后第1，3，7天分別進行利多卡因?qū)嶒?，檢測導(dǎo)管性能。對照組需消毒導(dǎo)管體外保留端，剪除密封末端，10 μL 2%利多卡因經(jīng)導(dǎo)管注射入蛛網(wǎng)膜下腔，隨后再使用10 μL無菌生理鹽水沖洗導(dǎo)管，加熱密封導(dǎo)管末端。應(yīng)用裝置組則需在體外觸摸注射囊位置，1 cc注射器經(jīng)皮穿刺穿刺囊底，感到明顯落空感后注射10 μL 2%利多卡因，隨后10 μL無菌生理鹽水沖洗導(dǎo)管。注射利多卡因后，如大鼠在30 s內(nèi)出現(xiàn)雙下肢麻痹，并持續(xù)20～30 min則證明導(dǎo)管性能正常。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有計數(shù)資料采用均數(shù)±標準差表示(mean±SD)，獨立樣本T檢驗和χ2檢驗用于數(shù)據(jù)分析，P＜0.05認為統(tǒng)計學差異顯著。

2 結(jié)果

本次試驗兩組大鼠術(shù)后均無死亡及明顯癱瘓情況;術(shù)前1d及術(shù)后第1，3，7天大鼠轉(zhuǎn)棒實驗及熱水甩尾實驗均未見兩組明顯差異(P＞0.05，獨立樣本T檢驗)，見表1;對照組大鼠體外導(dǎo)管末端在術(shù)后幾天內(nèi)被損毀或拔出，無法進行進一步實驗，應(yīng)用裝置組術(shù)后7 d所有末端均保持完整，術(shù)后利多卡因?qū)嶒烇@示導(dǎo)管功能良好(P＞0.05，χ2檢驗)，見表2。

表1 兩組大鼠轉(zhuǎn)棒實驗和熱水甩尾實驗在術(shù)前和術(shù)后不同時間點的檢測結(jié)果Tab.1 The results of motor and sensory function of two groups pre-and post-operation

表2 兩組造模后導(dǎo)管體外段保留情況Tab.2 The availability of external portion of the catheters postoperation in two groups

3 討論

自1976年Yaksh和Rudy介紹大鼠長期腰蛛網(wǎng)膜下腔置管技術(shù)并廣泛使用以來，不同的學者一直在努力完善和改進此模型，使其更加簡單，可靠，方便實驗操作以及減低因?qū)嶒灢僮饕鸬乃劳雎屎椭職埪剩?，5，6］。而其中一個重要的需要改進方面就是置管后大鼠體外端的保留以及注藥操作問題。目前大多學者選擇將導(dǎo)管體外段直接從傷口引出或在皮下潛行至大鼠枕后雙耳之間穿出皮膚固定，實踐證明在造模后的幾天內(nèi)，大鼠就會將所有導(dǎo)管損毀或拔出而無法進行長期實驗，有時不得不采取單籠飼養(yǎng)的方法來避免其它大鼠破壞導(dǎo)管［2，5，6］。一些學者發(fā)明了固定于大鼠體外的導(dǎo)管保護裝置，藉此來保護導(dǎo)管的體外段，其基本原理就是將一個抗大鼠撕咬的管狀裝置(金屬、塑料或其它材料)縫合固定于大鼠背部，并將導(dǎo)管末端置于保護裝置之內(nèi)［3，7］。體外保護裝置提高了導(dǎo)管的保存率，但并沒有完全解決此問題，體外裝置仍可能脫落或損毀，并且保護裝置縫于大鼠背部皮膚上，引起動物不適。本實驗我們設(shè)計了完全將導(dǎo)管末端保護裝置置于皮下的方式，完全解決了因動物原因損壞導(dǎo)管的問題，并且實驗表明，置入物和動物之間有很好的相容性，大鼠轉(zhuǎn)棒和熱水甩尾實驗也表明與對照組比較，裝置的置入沒有對模型的運動和感覺功能產(chǎn)生任何影響而干擾試驗結(jié)果。

與體外保留導(dǎo)管，采用加熱導(dǎo)管密封，每次注射都需要剪除末端，注射后再加熱密封的這種方法相比，采用經(jīng)皮穿刺穿刺囊注射的方式簡化了操作的過程，減少液體反流至導(dǎo)管內(nèi)的機會，以及感染的可能。可能盲穿穿刺囊底部會帶來一點麻煩，但是幾次練習之后就會熟練掌握這種穿刺技術(shù)。為了和穿刺囊進行緊密結(jié)合，我們采用了人腰蛛網(wǎng)膜下腔引流管來制作置入導(dǎo)管，通過在沸水中拉伸，可以得到理想的導(dǎo)管直徑，而既往也有學者報道置入蛛網(wǎng)膜下腔的導(dǎo)管直徑大小與造模后動物出現(xiàn)的神經(jīng)功能損傷的發(fā)生率相關(guān)［2，5］。本組實驗大鼠造模后未出現(xiàn)死亡和嚴重致殘的情況。

總之，我們設(shè)計制作了一種大鼠長期腰蛛網(wǎng)膜下腔置管末端的穿刺囊結(jié)構(gòu)，采用皮下保留，經(jīng)皮穿刺注射的方式，解決了大鼠置管后導(dǎo)管末端的保留問題，簡化注射操作過程，提高了傳統(tǒng)模型的可靠性和實用性，為一些需要長期反復(fù)注射研究提供了更為理想的模型制作方法。

［1］ Yaksh TL，Rudy TA. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space［J］.Physiol Behav，1976，17：1013-1016.

［2］ Storkson R，Kjorsvik A，Tjolsen A，et al.Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat［J］.J Neurosci Methods，1996，65：167-172.

［3］ Milligan ED，Hinde JL，Mehmert KK，et al.A method for increasing the viability of the external portion of lumbar catheters placed in the spinal subarachnoid space of rats［J］.J Neurosci Methods，1999，90：81-86.

［4］ Yaksh TL，Grafe MR，Melkmus S，et al.Studies on the safety of chronically administered intrathecal neostigmine methylsulfate in rats and dogs［J］.Anesthesiology，1995，82：412-427.

［5］ 鄒望遠，郭曲練，蔡進，等.Microspinal導(dǎo)管在大數(shù)蛛網(wǎng)膜下腔置管中的應(yīng)用［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2006，16：411-414.

［6］ Poon YY，Chang AY，Ko SF，et al.An Improved Procedure for Catheterization of the Thoracic Spinal Subarachnoid Space in the Rat［J］.Anesth Analg，2005，101：155-160.

［7］ Xu F，Li T，Zhang B.An improved method for protecting and fixing the lumbar catheters placed in the spinal subarachnoid space of rats［J］.J Neurosci Methods，2009，183：114-118.

A Device of Micro-catheter Protection for Chronic Lumbar Catheterization of the Spinal Subarachnoid Space in Rats

DU Shi-wei，BAO Xin-jie，F(xiàn)ENG Ming，WEI Jun-ji，GUO Xu，WANG Ren-zhi
(Department of neurosurgery，Peking Union Medical college Hospital，Beijing 100730，China)

Objective To develop a novel device for chronic lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in rat with a perfect protection of the external portion of catheter，and more convenient for repeat injection.Methods Pathogen-free adult male Sprague-Dawley rats were used in this study.Rats were divided into two groups(n=12 each)randomly.Rota-rod test and Tail-flick test were introduced to assess motor and sensory function respectively at one day preoperative and 1st，3rd，7th day postoperative.To evaluate functionality of the catheter，10 μL 2%lidocaine was injected in the catheter at 1st，3rd and 7th day post-catheterization.Results There were no mortality and overt paralysis in 2 groups.There is no significant difference in motor and sensory function between the two groups(P＞0.05，T test).Most external portions were destroyed a few days post operation in control group，however in group with device，all the catheters worked well(P ＜ 0.05，χ2test)and lidocaine test showed that functionality of the micro-catheters were normal 7 days after catheterization.Conclusion The novel device was reliable and convenient for repeat injection with a perfect protection function of the external portion of catheter，meanwhile it provided a more ideal model for chronic study in anesthesia，analgesia，neuroscience and relevant research.

Protection device;Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space;Rat

R331 R332

A

1671-7856(2011)03-0052-04

2010-08-25

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.013

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2006AA02A115)。

王任直(1957-)，主任醫(yī)師，研究方向：顱腦腫瘤及腦血管病。E-mail：wangrz@126.com。