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    急性肺損傷大鼠肺組織基質金屬蛋白酶2及其抑制因子蛋白和mRNA的表達

    2011-10-19 05:20:24蘇中昊楊愛東李文雯汪東穎吳中華龐慧芳
    中國比較醫(yī)學雜志 2011年3期
    關鍵詞:內毒素肺泡染色

    阮 瓊,蘇中昊,楊愛東,李文雯,汪東穎,吳中華,龐慧芳

    (1.上海市第八人民醫(yī)院急診內科,上海 200233;2.上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,上海 201203)

    急性肺損傷大鼠肺組織基質金屬蛋白酶2及其抑制因子蛋白和mRNA的表達

    阮 瓊1,蘇中昊2,楊愛東2,李文雯2,汪東穎2,吳中華2,龐慧芳2

    (1.上海市第八人民醫(yī)院急診內科,上海 200233;2.上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,上海 201203)

    目的 探討內毒素致急性肺損傷(ALI)大鼠肺組織核轉錄因子-κB(NF-κB)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)及其抑制因子(TIMP-2)蛋白和mRNA表達的變化。方法 20只雄性Wistar大鼠隨機分為2組:對照組、LPS模型組,每組再分為4 h和8 h兩個亞組。尾靜脈注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立大鼠急性肺損傷模型。檢測血白細胞計數、支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量,采用免疫組化ABC法和實時熒光定量PCR分別測定肺組織NF-κB、MMP-2、TIMP-2蛋白及其mRNA的表達,并觀察肺組織病理變化。結果 與對照組相比,模型組4 h和8 h時大鼠肺組織中的NF-κB、MMP-2蛋白染色陽性面積率及其 mRNA表達均顯著增高(P<0.01)、TIMP-2蛋白染色陽性面積率及其mRNA表達均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。病理學觀察顯示,模型組大鼠肺組織出現出血及壞死。結論 內毒素致急性肺損傷的發(fā)病機制可能與NF-κB、MMP-2蛋白及其mRNA表達升高、TIMP-2蛋白及其mRNA表達降低有關。

    脂多糖;急性肺損傷;NF-κB;MMP-2;TIMP-2

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是心源性以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭,以呼吸困難、難治性低氧血癥和非心源性肺水腫為臨床特征,嚴重的ALI或ALI的最終嚴重階段被定義為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[1],研究表明,核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)及其抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-2)在內毒素致急性肺損傷的發(fā)病中有重要作用。本實驗通過建立內毒素致ALI模型,觀察大鼠肺組織 NF-κB、MMP-2、TIMP-2蛋白及其 mRMA表達的變化,為揭示急性肺損傷的發(fā)病機制提供實驗依據。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    清潔級Wistar雄性大鼠20只,體重(220±20)g,由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[SCXK(滬)2007-005]。專用標準顆粒飼料、水喂養(yǎng)。

    1.2 主要試劑

    LPS:購自美國 Sigma 公司(LPS:O111:B4,批號 L-2630);NF-κBp65(NLS):sc-114 購自美國 Santa Cruz生物技術公司;大鼠MMP-2和TIMP-2免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;大鼠 NF-κB、MMP-2、TIMP-2和GAPDH引物和探針序列由廣州達輝生物技術有限公司合成,序列分別為:NF-κB:上游引物:5′-CTACACCGAAGCAATTGAAGTGA-3,下 游 引物:5′-CAGCGAGTGGGCCTGAGA-3,探針序列:5′-AGGCAGCCTCCAGCCCAGTGA-3,5′端 FAM 修飾;3′端 Tamra 修飾;MMP-2:上游引物: 5′-CCC ATG AAG CCT TGT TTA CCA-3′,下 游 引 物:5′-TGG AAG CGG AAC GGA AAC T-3′,探 針 序 列:5′-TGGCAATGCTGATGGACAGCC-3′,5′端 FAM 修飾,3′端 Tamra 修飾;TIMP-2:上游引物:5′-CTC ATC GCG GGC CGT TTA AG-3,下游引物:5′-GAA GGC TTC GGG TCA TCG AG-3′,探 針 序 列:5′-CATGGAGAGCCTCTGTGGAT-3′,5′端 FAM 修飾,3′端 Tamra 修飾;GAPDH:上游引物:5′-CCG AGG GCC CAC TAA AGG-3,下 游引物:5′-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA – 3,探針序列:5′-CATCCTGGGCTACACTGAGGACCA-3,5′端 FAM 修飾,3′端Tamra修飾。Trizol總 RNA提取試劑、反轉錄和PCR擴增所需的酶及其他試劑均購自美國Invitrogen公司。

    1.3 動物模型與分組

    按隨機數字表將大鼠隨機分為對照組、模型組,再隨機分為4 h、8 h兩個亞組(每組5只)。模型組經尾靜脈注射LPS(10 mg/kg)復制急性肺損傷大鼠模型[2,3],正常組注入等容積生理鹽水。

    1.4 動物標本制備

    所有動物均于設定的相應時相點(造模后4 h和8 h),用烏拉坦1.0 g/kg腹腔麻醉,分離大鼠腹主動脈,取一次性5 mL注射器從大鼠下腔靜脈抽取靜脈血約1 mL注入肝素鈉抗凝管中,混勻后進行白細胞計數檢測。取血后解剖大鼠頸部,暴露氣管,抽取生理鹽水灌洗支氣管,取離心后的支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF),用考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度;開胸分離右肺上葉用10%甲醛溶液固定,用于病理檢測及肺組織NF-kB、MMP-2和TIMP-2蛋白免疫組化檢測;右肺下葉置于液氮罐中作 NF-kBmRNA、MMP-2mRNA和 TIMP-2mRNA表達檢測。

    1.5 免疫組織法檢測肺組織 NF-κBp65、MMP-2及TIMP-2蛋白含量

    采用IMS細胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學圖像分析軟件,對免疫組織化學結果進行圖像采集和定量分析。每張切片在高倍鏡下隨機選擇不相重疊的3個視野,細胞核為藍色,NF-κBp65、MMP-2及 TIMP-2陽性細胞為棕黃色。計算出每例樣本的蛋白染色陽性面積率(蛋白染色陽性面積率 =陽性細胞面積/總面積)作為比較參數。

    1.6 實時熒光定量PCR檢測肺組織NF-κBmRNA、MMP-2mRNA及TIMP-2mRNA的表達

    按Trizol法提取總RNA后,逆轉錄合成 cDNA,在20 μL的反應體系中分別加入樣本RNA2 μg全文統(tǒng)一,RT buffer(5 × )4 μL,10mmoldNTPs 1 μL,N9 隨機引物 1 μL,逆轉錄酶 MMLV 1 μL,RNA 酶抑制劑1 μL,0.1 mol/LDTT2 μL,加 DEPC 處理水到 20 μL,混勻后于下列溫度反應:37℃1 h;95℃5 min,滅活MMLV,產物即為cDNA。PCR擴增:在50 μL反應體系中加入 cDNA 5 μL,ddH2O 水 32 μL,PCR buffer(5 × )10 μL,熒光探針 0.5 μL,Taq DNA 聚合酶1 μL,dNTPs 0.5 μL,TNF-α 上下游引物各0.5 μL,擴增條件:(1)93℃ 2 min(2)93℃ 45 s 55℃ 1 min,10 cycle(3)93℃ 30 s,55℃ 45 s,30 cycle。

    擴增產物分析:數據采用儀器自帶軟件ABI Prism 7300 SDS Software分析。NF-κBmRNA、MMP-2 mRNA及TIMP-2mRNA表達水平以它們與GAPDH的相對表達量來計算。

    1.7 肺組織病理學觀察

    制備肺組織標本,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織病理改變。

    1.8 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS13.0軟件包分析統(tǒng)計,所有數據均采用均數±標準差(±s)表示,多組均數采用單因素方差分析,組間兩兩比較用 LSD檢驗,以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 大鼠血白細胞計數及支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較

    與對照組相比,模型組4 h和8 h時白細胞計數明顯降低(P<0.05或 P<0.01),肺泡灌洗液的蛋白含量明顯升高(P<0.01)。(見表1)

    表1 兩組大鼠血白細胞計數及支氣管肺泡灌洗液蛋白含量比較 (n=5)Tab.1 Comparison of blood white blood cell count and protein content in BALF between the two groups(n=5)

    2.2 大鼠肺組織NF-κB、MMP-2及 TIMP-2蛋白染色陽性面積率的比較

    與對照組相比,模型組 4 h和 8 h時 NF-κB P65、MMP-2蛋白染色陽性面積率均明顯升高(P <0.01);TIMP-2蛋白染色陽性面積率明顯降低(P<0.01)(見表2)。

    表2 兩組大鼠肺組織NF-κB、MMP-2及TIMP-2蛋白染色陽性面積率的比較 (n=5)Tab.2 Comparison of expression of NF-κB ,MMP-2 and TIMP-2 protein dyeing positive rate of area in lung tissues between the two groups(n=5)

    2.3 大鼠肺組織 NF-κB、MMP-2及 TIMP-2mRNA表達的比較

    與對照組相比,模型組 4 h和 8 h時 NF-κB、MMP-2mRNA表達均顯著增高(P<0.01),TIMP-2mRNA表達均明顯降低(P<0.05)。(見表3)

    2.4 大鼠肺組織病理學改變

    光鏡觀察:對照組大鼠肺表面呈淡紅色,結構完整,肺泡隔均勻一致,組織小葉結構清晰,纖維結締組織無增生,肺泡腔清晰可見,肺泡壁無增厚,支氣管粘膜上皮完整,肺泡腔細支氣管腔未見明顯炎細胞及滲出物。模型組4 h與8 h時大鼠肺泡腔內充滿炎性滲出物和出血,肺泡壁毛細血管擴張充血,細支氣管粘膜上損傷部分脫落,管壁上大量淋巴細胞浸潤,管壁增厚,可見肺不張,肺氣腫(彩插3見圖1)。

    3 討論

    MMP-2屬于明膠酶的一種,亦稱明膠酶 A,MMP-2以無活性酶原的形式由多種細胞分泌,如成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞等,在激活劑的作用下轉變?yōu)槌墒斓拿?,其作用底物?IV、V型膠原。MMP-2激活與表達后,能降解基底膜的主要成分IV膠原,使基底膜變薄甚至斷裂,引起血管通透性增加、炎癥細胞浸潤,蛋白外滲,肺泡內液體增多、肺間質和肺泡水腫形成,甚至出現肺出血等。MMP-2是所有MMPs中分布最廣的,當細胞惡變或損傷時,常有MMP-2的升高[4]。研究表明,正常肺組織中MMP-2呈弱表達,而脂多糖(LPS)和前炎癥細胞因子(如 TNF-α)能促進 MMP-2 的表達[5]。本實驗顯示,正常對照組MMP-2 mRNA表達很低,靜脈注射內毒素后,MMP-2在轉錄水平的表達增高,此實驗結果與先前研究結果一致。

    TIMPs是一組內源性特異性抑制MMPs活性的糖蛋白,其與 MMPs形成 1∶1復合體而抑制其活性[6]。TIMP-2是 MMP-2的特異性抑制蛋白,特異性抑制MMP-2的活性。在正常肺組織中,細胞外基質的合成和降解保持動態(tài)平衡,這對于保證正常肺功能非常重要[7]。MMPs和 TIMPs的平衡被破壞時,肺泡上皮基底膜被破壞之后可導致肺泡上皮細胞受損,富含蛋白和蛋白酶的水腫液充滿肺泡,使表面活性物質滅亡。此外,基底膜完整性受到破壞后,各種損傷因子易于進入肺間質和肺泡腔,加重肺間質和實質損傷,進而引起肺功能障礙,導致肺泡萎陷和頑固性低氧血癥[8]。

    研究表明,轉錄因子 NF-κB在某些 MMP、TIMP基因啟動子上有某些特異性結合位點,當細胞外信號激活這些轉錄因子后即可誘導MMP、TIMP表達。NF-κB可跨膜激活 P53,間接誘導 MMP-2的轉錄;激活的NF-κB又可反饋上調 IL-6,TNF-α等促炎因子進一步影響 MMPs 表達[9,10]。

    本實驗結果表明,模型組大鼠肺組織出現出血及壞死,提示造模成功。與對照組相比,模型組大鼠肺組織中的NF-κB、MMP-2蛋白及其 mRNA表達均顯著增高(P<0.01)、TIMP-2蛋白及其 mRNA表達均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。提示內毒素致急性肺損傷的發(fā)病機制可能與 NF-κB、MMP-2蛋白及其 mRNA表達升高、TIMP-2蛋白及其 mRNA表達降低有關。

    表3 兩組大鼠肺組織NF-κB、MMP-2及TIMP-2 mRNA表達的比較 (n=4)Tab.3 Comparison of expression of NF-κB ,MMP-2 and TIMP-2 mRNA in lung tissues between the two groups(n=4)

    [1 ] Bernard GR,Artigas A,Brigham KL,et al.The American-Europe An Consensus Conference on ARDS: Definitions,mechanisms,relevant outcomes,and clinical trial coordination[J].Crit Care Med,1994,149(1):818-824.

    [2 ] Kao SJ,Wang D,Lin HI,et al.N-acetylcysteine abrogates acute lung injury induced by endotoxin[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2006,33(1 ~ 2):33-40.

    [3] 林英,朱曦,和宇,等.頸脊髓切斷對內毒素血癥大鼠急性肺損傷的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學,2008,20(10):621-624.

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    Expression of the MMP-2 and TIMP-2 Protein and Its mRNA in Rats with Acute Lung Injury Caused by Lipopolysaccharide

    RUAN Qiong1,SU Zhong-hao2,YANG Ai-dong2,LI Wen-wen2,WANG Dong-ying2,WU Zhong-hua2,PANG Hui-fang2
    (1.Department of Emergency Medicine,Shanghai Eingth People's Hospital,Shanghai 200233,China;2.The Basic Medicine College of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)

    Objective To investigate the changes of NF-κB,MMP-2 and TIMP-2 protein and its mRNA in the rats with acute lung injury(ALI)caused by lipopolysaccharide(LPS).Methods Twenty male Wistar rats were randomly divided into two groups: normal control group,LPS model group.Each group had two subgroups,4 hours and 8 hours after LPS were injected.The ALI model was established by intravenous injection of LPS(10 mg/kg)through a tailvein.Then the white blood cell(WBC)in blood and the protein content in bronchial alveolar lavage fluid(BALF)were measured,the expressions of nuclear factor-κB(NF-κB) ,matrixmetalloproteinase-2(MMP-2) and tissueinhibitorofmatrix metalloproteinases(TIMP-2)protein in pulmonary tissues were measured by immunohistochemistry ABC,the expression NF-κB ,MMP-2 and TIMP-2mRNA were measured by real-time fluorescent polymerase chain reaction(PCR) ,while the histopathology of the lung injury was observed by light microscope.Results Compared with normal group,the expression of NF-κB and MMP-2 protien dyeing positive rate of area and its mRNA in LPS model group were obviously increased at 4 hours and 8 hours(P<0.01) ,and the expression of TIMP-2 protein dyeing positive rate of area and its mRNA at 4 hours and 8 hours were obviously decreased in LPS model group(P<0.05or P<0.01).Light microscope observation indicatedthat there were pulmonary hemorrhage and necrosis in model group.Conclusion The increasing of expression NF-κB and MMP-2 protein and its mRNA and the decreasing of expression TIMP-2 protein and its mRNA may be the mechanism of ALI caused by LPS.

    Lipopolysaccharide;Acute lung injury;NF-κB;MMP-2;TIMP-2

    R563.9 R332

    A

    1671-7856(2011)03-0039-04

    2010-08-26

    10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.010

    上海市教委高校高水平特色發(fā)展項目(No.(2005)81);上海高校選拔培養(yǎng)優(yōu)秀青年教師科研專項基金(P13908)。

    阮瓊(1969-),女,主治醫(yī)師,主要從事急診醫(yī)學臨床與實驗研究。

    楊愛東,副教授,碩士生導師,主要從事中醫(yī)藥防治急性肺損傷的分子機制研究。aidongy@126.com。

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