DNA損傷修復(fù)與肺癌順鉑耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

唐春蘭 綜述 楊和平 周向東 審校

肺癌是目前世界上發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，研究[1]表明，至少有40%的肺癌患者在確診時(shí)已為晚期，僅有約25%的患者為I期，而對(duì)于晚期及部分中期及術(shù)后患者，化療是治療的主要手段之一。盡管對(duì)肺癌的化學(xué)治療取得了一定的進(jìn)展，但過去25年其5年生存率仍未見明顯提高，約為15%[2]。肺癌的化療是以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，其中，順鉑（cis-dichlorodiamine platinum,cisplatin, CDDP）是有效并廣泛應(yīng)用的一線藥物，但是由于耐藥問題的存在使其療效不盡如人意。

順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒藥物，含有類似烷化劑的雙功能基團(tuán)，與細(xì)胞內(nèi)親核基團(tuán)結(jié)合，無選擇地分布在腫瘤組織中，其主要作用靶點(diǎn)是DNA。順鉑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細(xì)胞DNA形成順鉑-DNA加合物，通過DNA-Pt-DNA結(jié)構(gòu)形成DNA鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)或通過DNA-Pt-蛋白質(zhì)形成DNA-蛋白交聯(lián)，破壞DNA的正常結(jié)構(gòu)，阻礙DNA的模板作用，進(jìn)而抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3,4]。因此，DNA損傷修復(fù)功能的異常是順鉑耐藥的主要機(jī)制之一。

DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在抗癌過程中起到極為重要的作用，其功能增強(qiáng)會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥產(chǎn)生拮抗，使化療失敗[5]，同時(shí)受損DNA的異常修復(fù)可能會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。機(jī)體對(duì)DNA的損傷修復(fù)包括：①直接修復(fù)（direct repair, DR）：修復(fù)O6-烷基-鳥嘌呤引起的損傷；②堿基切除修復(fù)（base excision repair, BER）：針對(duì)氧化還原或烷基化引起的堿基損傷；③核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair, NER）；④DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair, MMR）；⑤DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)；⑥跨損傷修復(fù)（translesion synthesis, TLS）。本文主要綜述與肺癌順鉑耐藥相關(guān)的DNA損傷修復(fù)異常。

1 NER

DNA的損傷修復(fù)過程包括損傷識(shí)別、切開、切除、修復(fù)合成和DNA連接等5個(gè)步驟，NER的修復(fù)通過切除藥物或者紫外線等損傷的DNA而形成的DNA加合物，以互補(bǔ)鏈為模板復(fù)制并修復(fù)損傷DNA來維護(hù)基因組的完整性。其中，DNA損傷的識(shí)別/切除為限速步驟。

1.1 切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair crosscomplementing gene 1, ERCC1） ERCC1位于染色體19q13.2，基因全長(zhǎng)15 kb，編碼含297個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，ERCC1與XPF形成的異二聚體具有5′DNA核酸內(nèi)切酶活性，具有損傷識(shí)別和切除5′端的雙重作用，在NER中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用[6]，其活性的高低可反映整個(gè)NER修復(fù)活性的水平[7]。ERCC1過表達(dá)可使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復(fù)，尤其是ERCC1能使順鉑誘導(dǎo)的DNA絡(luò)合物的清除增加，導(dǎo)致其對(duì)順鉑耐藥。此外，研究[8,9]表明，ERCC1-XPF復(fù)合物也可以通過同源組合修補(bǔ)DNA雙聯(lián)斷裂損傷從而引起肺癌順鉑耐藥。

研究[10,11]表明，ERCC1在肺癌組織和細(xì)胞系中均存在過表達(dá)，其表達(dá)水平以肺鱗癌最高，而肺腺癌最低。Arora等[9]采用RNA干擾的方法降低非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細(xì)胞中ERCC1-XPF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)XPF蛋白水平隨ERCC1下調(diào)而減低，順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能力隨XPF、ERCC1、ERCC1-XPF表達(dá)的下調(diào)而降低，鏈內(nèi)交聯(lián)引起的DNA雙鏈斷裂在XPF-ERCC1缺失時(shí)持續(xù)存在，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1-XPF復(fù)合物抑制的細(xì)胞活性減弱，對(duì)順鉑敏感性增加，且同時(shí)抑制XPF和ERCC1較單獨(dú)抑制XPF或ERCC1細(xì)胞毒性更強(qiáng)。在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，ERCC1的表達(dá)水平與肺癌以鉑類（主要是順鉑）為基礎(chǔ)的化療臨床結(jié)果負(fù)相關(guān)。Wang等[12]應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了ERCC1在124例晚期NSCLC的石蠟切片的表達(dá)情況，回顧性地分析了它們對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的化療患者的化療有效性及生存期的預(yù)測(cè)作用。結(jié)果顯示，ERCC1的陽性表達(dá)率為35%（43/124），ERCC1的表達(dá)與腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)負(fù)相關(guān)，沒有表達(dá)ERCC1的患者部分緩解率為54%，而表達(dá)該蛋白的患者僅為33%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022），進(jìn)一步分析，缺乏ERCC1表達(dá)的患者具有更長(zhǎng)的中位生存期（13.4個(gè)月 vs 9.1個(gè)月，P=0.006 ）。Li等[13]通過對(duì)66例晚期NSCLC未治療前經(jīng)支氣管肺活檢標(biāo)本中ERCC1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)得出結(jié)論，ERCC1低表達(dá)接受以順鉑為基礎(chǔ)的化療效果較好，總生存期（overall survival,OS）延長(zhǎng)。但是，對(duì)于不予化療的肺癌患者，ERCC1的陰性表達(dá)可能為生存預(yù)后較差的指標(biāo)。Olaussen等[14]采用免疫組化方法檢測(cè)了國際肺癌臨床試驗(yàn)入組的761例NSCLC患者手術(shù)切除腫瘤組織中的ERCC1的表達(dá)情況，其中ERCC1陽性335例（44%），ERCC1陰性426 例（56%）。ERCC1陰性的患者隨機(jī)接受輔助化療明顯延長(zhǎng)生存時(shí)間（P=0.002）；ERCC1陽性患者無論是否接受輔助化療與否，生存情況沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.400）；對(duì)于沒有接受輔助化療的患者，ERCC1陽性患者生存時(shí)間長(zhǎng)于ERCC1陰性患者（P=0.009）。因此他們認(rèn)為：手術(shù)完全切除的ERCC1陰性的NSCLC患者更適合基于順鉑的輔助化療；對(duì)于未予輔助化療的患者，ERCC1陰性是預(yù)示著較短生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。以上研究表明，ERCC與肺癌順鉑原發(fā)耐藥相關(guān)，同時(shí)也說明ERCC1在肺癌中具有雙重作用，此與近年認(rèn)為DNA損傷修復(fù)是雙刃劍的理論相符。此外，ERCC1基因的多態(tài)性也能影響肺癌順鉑耐藥[15]。

1.2 核糖核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase, RRM l） RRM1是核苷酸還原酶的組成部分，而核苷酸還原酶是脫氧核苷酸產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，是DNA合成與修補(bǔ)必需酶[16]，也是DNA合成及修復(fù)的限速酶，其基因定位于染色體11p15.5。在NER途徑中順鉑加合物導(dǎo)致的核苷酸損害，所造成的間隙由RRM1提供的DNA合成前體所充填，執(zhí)行分裂溝填充的功能。此外RRM1還參與吉西他濱代謝。

目前認(rèn)為，RRM1是判斷NSCLC惡性行為的一個(gè)生物學(xué)和臨床的重要指標(biāo)。RRM1是腫瘤抑制基因[17]，其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Bepler等[18]研究表明，在多因素分析中，RRM1表達(dá)是預(yù)測(cè)生存延長(zhǎng)的指標(biāo)，RRM1與PTEN表達(dá)增高的患者與表達(dá)降低的患者相比較其生存延長(zhǎng)，復(fù)發(fā)延遲。但在化療損傷后DNA修補(bǔ)期間，卻發(fā)現(xiàn)人類RRM1被上調(diào)[19]，但卻對(duì)化療的反應(yīng)性下降。Wang等[12]應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了RRM1在124例晚期NSCLC的石蠟切片的表達(dá)情況，回顧性的分析了它們對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的化療患者的化療有效性，結(jié)果顯示RRM1的陽性表達(dá)率為40%（50/124），且RRM1的表達(dá)與腫瘤對(duì)化療的反應(yīng)負(fù)相關(guān)，沒有表達(dá)RRM1的患者部分緩解率為54%，而表達(dá)該蛋白的患者僅為36%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.042）。然而，盡管RRM1高表達(dá)的晚期NSCLC患者接受以吉西他濱+順鉑化療具有更差的臨床結(jié)果，但是接受手術(shù)的NSCLC患者，RRM1高表達(dá)則具有更長(zhǎng)的生存期[15]。以上研究說明RRM1可能與順鉑的獲得性耐藥相關(guān)。

2 DNA錯(cuò)配修復(fù)

MMR是細(xì)胞復(fù)制后一種修復(fù)機(jī)制，該系統(tǒng)的主要功能是修復(fù)DNA的堿基錯(cuò)配損傷，以保持DNA忠實(shí)復(fù)制，控制基因突變，在保持基因的完整性上具有重要作用。目前共發(fā)現(xiàn)人類有9種錯(cuò)配修復(fù)基因（human mismatch repair genes, hMMR genes），即hMLH1、hMLH3、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6、hPMS1和hPMS2。其中，hMLH1和hMSH2的作用最為重要[3]。

研究[20-22]表明，在肺癌組織中普遍存在錯(cuò)配修復(fù)基因的低表達(dá)，尤其是在吸煙的男性患者中更為突出，提示DNA錯(cuò)配修復(fù)功能的缺陷與肺癌的形成有關(guān)。此外，錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)也與肺癌順鉑耐藥相關(guān)。Scartozzi等[23]應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了93例晚期NSCLC腫瘤標(biāo)本中hMLH1和hMSH2的表達(dá)情況，所有的患者均接受順鉑或奧沙利鉑與吉西他濱的聯(lián)合化療，結(jié)果顯示，缺失hMSH2表達(dá)的患者，奧沙利鉑+吉西他濱組的化療應(yīng)答率為38%，而順鉑+吉西他濱組完全無效，提示對(duì)hMSH2缺失對(duì)順鉑耐藥；最近，Cheng等[24]研究報(bào)道了hMSH2和hMLH1單核苷酸多態(tài)性與接受以鉑類（順鉑或卡鉑）為基礎(chǔ)化療的晚期NSCLC患者對(duì)化療反應(yīng)的關(guān)系。一共對(duì)96例中國晚期NSCLC患者進(jìn)行了檢測(cè)，取其外周血淋巴細(xì)胞通過三維聚丙烯酰胺凝膠脫氧核糖核酸微陣列方法分析hMSH2 gIVS12-6T/C和hMLH1-1151T/A與化療的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hMSH2 gIVS12-6T/C化療效果更好。吳等[25]研究了hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化與NSCLC細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系。他們選擇A549親代及順鉑耐藥細(xì)胞株進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，hMLH1 mRNA在A549中的表達(dá)高于A549/DDP細(xì)胞，A549細(xì)胞hMLH1為非甲基化狀態(tài)，A549/DDP細(xì)胞為部分甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）去甲基作用后，hMLH1呈非甲基化狀態(tài)；A549組、A549/DDP組、經(jīng)10 μmol/L 5-Aza-CdR干預(yù)后的A549/DDP組經(jīng)順鉑作用后的IC50值分別為（4.7±0.7）μmol/L、（30.1±1.8）μmol/L和（6.9±0.6）μmol/L；5-Aza-CdR干預(yù)后的A549/DDP細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后，比單用順鉑抑制A549/DDP細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)改變明顯，凋亡小體以及核固縮現(xiàn)象增多，因此作者認(rèn)為：hMLH1甲基化可能參與了A549/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥過程；5-Aza-CdR能抑制hMLH1甲基化，恢復(fù)hMLH1表達(dá)，并能增強(qiáng)順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖抑制和凋亡。

3 DNA雙聯(lián)斷裂修復(fù)

BRCA1（breast cancer type 1 susceptibility gene）作為一種抑癌基因，其表達(dá)的蛋白具有重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和泛素化等。BRCA1與MRE1/RAD50/NBS1復(fù)合物相互作用，共同參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)。另有研究還表明BRCA1通過c-JNκ通路參與細(xì)胞周期的調(diào)控與凋亡[26]，而這些機(jī)制都可能與順鉑的耐藥相關(guān)，阻止該通路會(huì)增加細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性[27]。

Miquel等[28]對(duì)接受了吉西他濱/順鉑新輔助化療的NSCLC手術(shù)患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)BRCA1 mRNA表達(dá)水平與患者中位生存期明顯相關(guān)，BRCA1在NSCLC中高表達(dá)患者的生存期明顯縮短。尤其是四分位分組時(shí)，BRCA1表達(dá)最低組的中位生存期還沒能得出，中間兩個(gè)組的中位生存期為37.9個(gè)月，最高組為12.7個(gè)月。Rosell等[29]在126例可切除NSCLC患者的9個(gè)基因mRNA檢測(cè)中，僅有BRCA1 mRNA的表達(dá)是III期NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因素；40例BRCA1高表達(dá)患者中位生存期29個(gè)月（22.2個(gè)月-35.7個(gè)月），而83例BRCA1低表達(dá)者尚未達(dá)到，提示BRCA1高表達(dá)是預(yù)后差的標(biāo)志。既往實(shí)驗(yàn)[30]表明BRCA1過表達(dá)可以增加多西紫杉醇的敏感性而對(duì)順鉑耐藥，Rosell等[31]在臨床試驗(yàn)中也得出相似的結(jié)果，他們根據(jù)123例已發(fā)生轉(zhuǎn)移的非鱗癌NSCLC腫瘤標(biāo)本中BRCA1 mRNA的表達(dá)情況選擇不同的化療方案，低表達(dá)者選擇順鉑+吉西他濱，中表達(dá)者選擇順鉑+多西紫杉醇，高表達(dá)者選擇多西紫杉醇，結(jié)果顯示2年生存率分別為41.2%、15.6%和0，提示BRCA1的高水平表達(dá)可能會(huì)降低以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的2年生存率，而部分原因可能是由于BRCA1高水平表達(dá)者對(duì)順鉑耐藥，因此可根據(jù)BRCA1的表達(dá)水平制定化療方案。

4 TLS

盡管順鉑導(dǎo)致的DNA損傷可以通過核苷酸切除修復(fù)及鏈內(nèi)交聯(lián)修復(fù)去除，但仍有一些損傷存在。細(xì)胞忽略容忍未修復(fù)的DNA損傷的機(jī)制就是TLS，它是由一組專門的DNA聚合酶來執(zhí)行的，TLS聚合酶可以繞過未修復(fù)的DNA損傷繼續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的TLS聚合酶包括polη（POLH）、polι（POLI）、polκ（POLK）、REV1和polζ （REV3和REV7），每個(gè)酶都有專門的作用底物，對(duì)順鉑而言，polη和polζ可以繞過順鉑-GG加合物繼續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制[32,33]。

TLS耐受順鉑導(dǎo)致?lián)p傷的重要性在TLS聚合酶活性缺失的細(xì)胞得到明顯的體現(xiàn)。對(duì)包括肺癌細(xì)胞在內(nèi)的人細(xì)胞系中polη活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)polη活性缺失的細(xì)胞對(duì)順鉑導(dǎo)致的DNA損傷增加，對(duì)順鉑更為敏感[34,35]。在另一項(xiàng)研究[36]中也發(fā)現(xiàn)，比較polη缺失的細(xì)胞和用補(bǔ)體致活polη的同樣細(xì)胞對(duì)順鉑、卡鉑、奧沙利鉑的敏感性，發(fā)現(xiàn)前者更敏感。在臨床研究中，Ceppi等[37]檢測(cè)了72例NSCLC患者的石蠟包埋腫瘤標(biāo)本的polη mRNA的表達(dá)情況，所有患者均接受以鉑類為基礎(chǔ)化療，發(fā)現(xiàn)polη的表達(dá)水平與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)者生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)者（6.9個(gè)月 vs 21.1個(gè)月，P=0.003），進(jìn)一步說明其與肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性。

5 結(jié)語

肺癌順鉑耐藥是由多因素多因子參與的，任何一種機(jī)制都不可能完全解釋肺癌順鉑耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，而且，一些在臨床前研究確認(rèn)的肺癌順鉑耐藥相關(guān)因子在臨床應(yīng)用中的意義尚未完全闡明，有的是剛剛開展。因此，一方面，有必要對(duì)肺癌順鉑耐藥機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行縱深研究；另一方面，可以根據(jù)目前已經(jīng)得到的研究結(jié)果制定相應(yīng)的方案克服肺癌順鉑耐藥，如ERCC1、BRCA1的表達(dá)水平的不同直接影響NSCLC患者應(yīng)用順鉑化療敏感程度及預(yù)后，因此可以根據(jù)基因的表達(dá)情況來選擇性用藥，但目前這些研究還是比較初步的，雖然已開始了一些前瞻性研究[38]，但大多基于回顧性的研究結(jié)果。此外，順鉑與一些靶向藥物的聯(lián)合應(yīng)用也是克服其耐藥的方法之一，如VEGF單克隆抗體貝伐珠單抗與順鉑+吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用治療非鱗NSCLC，可提高化療反應(yīng)性并延長(zhǎng)患者生存時(shí)間[39]。最后，可以開發(fā)新的鉑類藥物來克服順鉑的耐藥，這些藥物與順鉑部分或完全沒有交叉耐藥[40,41]。例如，奧沙利鉑由于細(xì)胞攝入機(jī)制不同（較少依賴于Ctr1）可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少及MMR蛋白不能識(shí)別奧沙利鉑誘導(dǎo)的DNA損傷從而缺乏交叉耐藥性[42]；Satraplatin和picoplatin在NSCLC中也顯示出較好的臨床活性[41]；Tang等[43]報(bào)道picoplatin可以通過提高細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度對(duì)耐順鉑和卡鉑的NSCLC仍然具有細(xì)胞毒性，最近的一項(xiàng)II期臨床實(shí)驗(yàn)[44]也表明picoplatin對(duì)耐其他鉑類藥物的SCLC顯示出較好的臨床效果。相信隨著肺癌順鉑耐藥機(jī)制研究的深入長(zhǎng)期困擾肺癌化療的耐藥問題必將得以解決。