阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠的行為學(xué)檢測(cè)方法

李子艷，馬慧冬

內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏海 016000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease,AD）是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。本文主要是對(duì)目前國(guó)內(nèi)外常采用的AD轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)測(cè)試方法作一綜述。

1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris water maze）

Morris水迷宮是由英國(guó)心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)發(fā)明的，是目前最可靠有效的檢驗(yàn)動(dòng)物行為記憶功能的方法。這種裝置可觀察并記錄動(dòng)物入水后搜索目標(biāo)所需的時(shí)間、采用的策略和它們游泳的軌跡，有助于分析和推斷單位的學(xué)習(xí)、記憶、空間定向和認(rèn)知功能等方面的能力。目前廣泛運(yùn)用在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置是一個(gè)直徑約1 m的圓形水池，水池直徑的大小因?qū)嶒?yàn)者的習(xí)慣或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的大小而不同。填充物為不透明液體，如牛奶或其他人工合成的不透明劑。實(shí)驗(yàn)將水池分為4個(gè)象限，在目標(biāo)象限中央液面下1~2 cm的位置放置一個(gè)直徑約為10 cm的圓形平臺(tái)。一般將池內(nèi)的液體的溫度控制在25℃左右。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為兩個(gè)階段：定向航行實(shí)驗(yàn) （place navigation test）和空間探索實(shí)驗(yàn)（spatial probe test）。定向航行實(shí)驗(yàn)是學(xué)習(xí)階段，一般進(jìn)行4~9 d，每天訓(xùn)練4次。每次將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)選擇一個(gè)象限面朝池壁放入水池中并開(kāi)始計(jì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到目的象限中隱藏平臺(tái)所用的時(shí)間，即為逃避潛伏期。每次訓(xùn)練時(shí)間限制為60 s或120 s，找到平臺(tái)后允許動(dòng)物在臺(tái)上休息10~30 s，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在限制時(shí)間內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)，則幫助其找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為限制時(shí)間。由計(jì)算機(jī)視頻軟件系統(tǒng)自動(dòng)跟蹤記錄逃避潛伏期、游泳速度、繪制游泳軌跡等。空間探索試驗(yàn)是記憶階段。此階段撤去目的象限隱藏的平臺(tái)，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在限制時(shí)間內(nèi)在水池中自由游泳，計(jì)算機(jī)記錄動(dòng)物在各象限時(shí)間、穿越平臺(tái)位置次數(shù)、游泳速度、繪制軌跡圖等[1-4]。第四象限時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)是最有意義的觀察指標(biāo)。Morris水迷宮檢測(cè)的是動(dòng)物的空間參考記憶最為經(jīng)典的行為學(xué)檢測(cè)方法。

之后的研究者在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了很多改進(jìn)，如Markowska[5]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)階段將平臺(tái)設(shè)計(jì)為間歇地出現(xiàn)，這種方法可更加有效地檢測(cè)動(dòng)物的空間參考記憶能力。Arteni[6]在水迷宮中采用了兩個(gè)隱藏平臺(tái)，輪流升起不同平臺(tái)的方法還可以檢測(cè)動(dòng)物的工作記憶。Morris水迷宮廣泛用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的視覺(jué)相關(guān)的空間記憶和工作記憶的檢測(cè)中，但對(duì)于檢測(cè)動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)程記憶的可靠性仍存在爭(zhēng)議。

2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevated plus-maze test）

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)動(dòng)物焦慮情緒和活動(dòng)能力的行為學(xué)方法，被廣泛應(yīng)用在抑郁癥、癡呆等疾病模型的相關(guān)研究中。迷宮的基本裝置主要由呈十字交叉的兩條開(kāi)臂（50cm×10 cm×10 cm）和兩條閉臂（50 cm×10 cm×40 cm）組成，迷宮的底部距離地面50~100 cm不等。四條臂的內(nèi)部均漆成黑色，室內(nèi)保持安靜暗光。動(dòng)物從四條臂的交叉區(qū)域面向閉臂放入。計(jì)算機(jī)視頻軟件系統(tǒng)自動(dòng)記錄動(dòng)物的活動(dòng)情況，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5 min。

實(shí)驗(yàn)主要觀察的數(shù)據(jù)包括：閉臂和開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)（至少兩只前爪進(jìn)入臂內(nèi)）和停留時(shí)間。并計(jì)算動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和在開(kāi)臂滯留時(shí)間分別占進(jìn)入兩臂總次數(shù)和總時(shí)間的百分比[7-8]。高架十字迷宮是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探索性和對(duì)高懸敞開(kāi)臂的恐懼，測(cè)試動(dòng)物在復(fù)雜環(huán)境中的自主活動(dòng)能力和焦慮程度。動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和在開(kāi)臂滯留時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明動(dòng)物的自主活動(dòng)能力越高，而焦慮程度越低。許多研究發(fā)現(xiàn)AD轉(zhuǎn)基因小鼠在高架十字迷宮中表現(xiàn)出焦慮程度增加，自主運(yùn)動(dòng)能力降低。

3 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test)

開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)同樣可以檢測(cè)動(dòng)物的焦慮程度和自主活動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)裝置主要為一60 cm×60 cm×40 cm大小的頂部開(kāi)口的箱體。箱底內(nèi)面被平均劃分為25個(gè)方格，靠近箱壁一圈的方格稱(chēng)之為外周格，靠近內(nèi)部的方格稱(chēng)之為中央格。實(shí)驗(yàn)將動(dòng)物放入正中一格，計(jì)算機(jī)視頻軟件系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)動(dòng)物的活動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)時(shí)間一般設(shè)定在7∶00~12∶00 am，2次實(shí)驗(yàn)之間將箱底打掃干凈。

實(shí)驗(yàn)主要觀察的指標(biāo)為爬行格子總數(shù)和中央格爬行時(shí)間。齲齒類(lèi)動(dòng)物喜歡在黑暗的角落環(huán)境活動(dòng)，寬敞明亮的環(huán)境會(huì)使其焦慮程度增加。在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中爬行格子總數(shù)反映小鼠的自主活動(dòng)能力，中央格停留時(shí)間可以衡量小鼠的焦慮情緒。研究表明AD轉(zhuǎn)基因小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)焦慮程度增加，爬行格子總數(shù)減少，中央格爬行時(shí)間縮短[9-12]。

4 放射狀迷宮實(shí)驗(yàn)

放射狀迷宮實(shí)驗(yàn)放射性迷宮最先由Ohon和Samuelson于1976年應(yīng)用于動(dòng)物的空間記憶研究，之后在行為學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)方法也得到不斷改進(jìn)。

實(shí)驗(yàn)裝置由一個(gè)中央平臺(tái)和多條放射臂組成，放射臂的數(shù)目不定，多為8條臂。臂長(zhǎng)多為50~60 cm，臂寬10 cm，臂的末端放置一個(gè)食物盒，迷宮放置在距離地面50 cm高度實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所中設(shè)計(jì)一些外形明顯的物體作為動(dòng)物空間參照目標(biāo)。常用的實(shí)驗(yàn)方案有以下3種：①所有的臂上的食物盒中都放有食物，把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置在中央平臺(tái)上，記錄動(dòng)物進(jìn)入放射臂的正確次數(shù)（未探索過(guò)的臂）及錯(cuò)誤次數(shù)（已探索過(guò)的臂）。此方案主要反映了動(dòng)物的工作記憶；②同樣在所有的臂上食物盒都放有食物，記錄探索完所有臂需要的總次數(shù)（最大25次），按公式（day2+day3+day4+day5）－4×day1 的計(jì)算結(jié)果。 評(píng)估與海馬皮層功能相關(guān)的空間記憶；③部分放射臂中的食物盒中放置食物，記錄動(dòng)物進(jìn)入放射臂的正確次數(shù)（進(jìn)入有食物的臂）和錯(cuò)誤次數(shù)（進(jìn)入沒(méi)有食物的臂），此方案主要反映了動(dòng)物的空間記憶[9]。

部分研究將實(shí)驗(yàn)中促使動(dòng)物完成實(shí)驗(yàn)的獎(jiǎng)賞性措施（食物）換為厭惡性刺激，如放射臂水迷宮（Radial Arm water Maze）[13-14]。實(shí)驗(yàn)裝置包括一個(gè)直徑100 cm不等的圓形水池，多為6個(gè)放射狀分布的游泳臂，在某一臂的末端放置一逃避平臺(tái)。一天進(jìn)行4次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，每次約1 min。每次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)小鼠被放在沒(méi)有放置逃離平臺(tái)的臂內(nèi)——開(kāi)始臂。下次實(shí)驗(yàn)應(yīng)重新隨機(jī)選擇另一個(gè)開(kāi)始臂，每個(gè)臂只能選擇一次。記錄小鼠探索的錯(cuò)誤次數(shù)（如果小鼠探索錯(cuò)誤，將會(huì)被放回開(kāi)始臂重新進(jìn)行探索）。1 d的4次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，小鼠錯(cuò)誤次數(shù)的減少作為學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。結(jié)束后，將小鼠放回窩30 min，再以第4次學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)相同的開(kāi)始臂進(jìn)行一次記憶實(shí)驗(yàn)。

5 T型迷宮實(shí)驗(yàn)

T型迷宮是檢測(cè)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)、工作記憶、交替行為的行為學(xué)檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于AD轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)研究中。T型迷宮通常為兩條等長(zhǎng)的垂直通道，形狀如T型。每條通道除底面為黑色外，其他三面由透明樹(shù)脂組成。通道尺寸一般為75 cm×12 cm×20 cm，其中豎直通道的末端用不透明活動(dòng)門(mén)隔出一通道作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的起始位置。水平通道的兩端分別作為兩個(gè)目標(biāo)位置，在由豎直通道進(jìn)入水平通道的入口處分別有兩扇不透明活動(dòng)門(mén)，可以通向通道左右兩側(cè)方向，實(shí)驗(yàn)者可以控制活動(dòng)門(mén)的開(kāi)放。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所放置外形明顯的物體作為視覺(jué)參照物。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置在起始位置處，打開(kāi)水平通道入口處其中一扇活動(dòng)門(mén)。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索完一側(cè)水平通道回到起始位置后，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在起始位置內(nèi)滯留5 s，而后將入口處兩扇活動(dòng)門(mén)全部打開(kāi)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入水平通道一側(cè)后，關(guān)上另一側(cè)的活動(dòng)門(mén)，待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物回到起始區(qū)域一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束。重復(fù)第二個(gè)步驟14次。記錄動(dòng)物每次實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間、每次進(jìn)入和前一次不同側(cè)通道的比例[15]。

研究者認(rèn)為此種T型迷宮無(wú)獎(jiǎng)賞或懲罰因素，動(dòng)物探索的天性是完成實(shí)驗(yàn)的動(dòng)機(jī)，因此能最大限度地減少影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的混雜因素[16]。但另有研究者發(fā)現(xiàn)嚙齒動(dòng)物存在天生的偏側(cè)優(yōu)勢(shì)，即動(dòng)物在T型迷宮中更偏向于向一邊走（左邊或右邊），而且這種現(xiàn)象存在種系差異以及性別差異，各種應(yīng)激（如饑餓）可以減弱這種偏側(cè)優(yōu)勢(shì)。Y型迷宮是一種同T型迷宮類(lèi)似的檢測(cè)方法，其實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理和實(shí)驗(yàn)方案和T型迷宮都十分相似，只是把迷宮的形狀由T型換成了Y型。

6 Barnes迷宮

1979年Barnes首次采用Barnes迷宮來(lái)評(píng)定動(dòng)物的空間記憶能力。Barnes迷宮由一個(gè)距離地面50 cm以上的圓形平臺(tái)構(gòu)成，平臺(tái)周邊設(shè)有10~30個(gè)穿透的小洞。平臺(tái)的直徑、厚度以及洞口寬度根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同而不同。在平臺(tái)上方給予強(qiáng)光、噪聲以及風(fēng)吹等刺激，在平臺(tái)周邊選擇一個(gè)小洞底部放置一個(gè)盒子，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)刺激的躲避場(chǎng)所；其他洞的底部是空的，試驗(yàn)動(dòng)物無(wú)法進(jìn)入其中。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所放置外形明顯的物體作為視覺(jué)參照物。動(dòng)物利用提供的視覺(jué)參照物，有效確定躲避場(chǎng)所的洞口所在空間。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)把實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放置在高臺(tái)中央，記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物找到正確洞口的時(shí)間，以及進(jìn)入錯(cuò)誤洞口的次數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用70%的酒精對(duì)洞口進(jìn)行清洗，變換可以躲避的洞口，但洞口的空間位置不變[17]。相對(duì)于其他行為學(xué)檢測(cè)方法而言，Barnes迷宮具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①不需要食物剝奪或電擊，因此對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激較?。虎趯?shí)驗(yàn)對(duì)于動(dòng)物的體力要求很小，能最低限度地減少因年齡因素所致的體力下降對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；③實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間較少。

7 其他

7.1 新事物識(shí)別實(shí)驗(yàn)

它是基于嚙齒類(lèi)動(dòng)物具有探索新事物的先天性趨向，探索新事物的過(guò)程反映了動(dòng)物學(xué)習(xí)、識(shí)別和記憶的過(guò)程，用來(lái)評(píng)估動(dòng)物短記憶的缺損。

7.2 場(chǎng)景性恐懼條件化測(cè)試

常用的嚙齒類(lèi)動(dòng)物情緒性記憶的測(cè)試有兩種：場(chǎng)景性恐懼條件化（contextual fear condition）與提示性恐懼條件化（cued fear condition）。前者測(cè)試的內(nèi)容是海馬依賴(lài)型記憶，而后者測(cè)試的內(nèi)容是海馬非依賴(lài)型記憶。實(shí)驗(yàn)分階段地記錄動(dòng)物僵直不動(dòng)（freezing）的時(shí)間，作為評(píng)價(jià)結(jié)果的依據(jù)。

7.3 平衡木測(cè)試

用來(lái)測(cè)試動(dòng)物的平衡能力和運(yùn)動(dòng)能力，小鼠被放在一個(gè)長(zhǎng)50.8 cm，寬1.2 cm的長(zhǎng)木上（懸掛在46 cm高處），兩端各有一個(gè)14.0 cm×10.2 cm的逃避平臺(tái)。記錄每次實(shí)驗(yàn)小鼠掉下長(zhǎng)木或到達(dá)逃避平臺(tái)的時(shí)間（最長(zhǎng)監(jiān)視60 s，如果小鼠成功到達(dá)逃避平臺(tái)則記錄為60 s），三次實(shí)驗(yàn)后計(jì)算平均時(shí)間。

7.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?duì)動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的適應(yīng)性、探究、緊張、記憶等行為進(jìn)行評(píng)價(jià)。在一箱體中，底部鋪以銅柵，銅柵通電。箱體底部中央放置一平臺(tái)（大小和高度根據(jù)測(cè)試動(dòng)物而定）。當(dāng)把動(dòng)物放在平臺(tái)上時(shí)，會(huì)跳下平臺(tái)并向四周進(jìn)行探索。如果動(dòng)物跳下平臺(tái)時(shí)受到電擊時(shí)會(huì)跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。記錄首次跳下平臺(tái)的潛伏期、一定時(shí)間內(nèi)受電擊的次數(shù)（錯(cuò)誤次數(shù)）。24 h后重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次，記錄動(dòng)物首次跳下平臺(tái)的潛伏期和一定時(shí)間內(nèi)的錯(cuò)誤總數(shù)。

AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型也表現(xiàn)出類(lèi)似人類(lèi)AD患者的各種特征，記憶力下降，反應(yīng)遲鈍，理解力、判斷力降低。但對(duì)于小鼠這種低等的嚙齒類(lèi)動(dòng)物，我們只能設(shè)計(jì)各種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)其行為改變來(lái)推測(cè)其認(rèn)知，記憶的改變。目前最常用的是各種各樣的迷宮模型，來(lái)檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。相信將來(lái)會(huì)有更多科學(xué)的檢測(cè)方法，用于AD病理模型的研究。

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