血管內(nèi)皮生長因子的調(diào)控及其作用研究進(jìn)展

蔡源源 綜述 李光早 審校

血管內(nèi)皮生長因子 （Vascular endothelial growth factor，VEGF）具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增殖，增加微靜脈、小靜脈的通透性，誘導(dǎo)絲氨酸蛋白酶和間質(zhì)膠原酶的表達(dá)，使細(xì)胞質(zhì)鈣聚集，誘導(dǎo)血管生成，在創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。

1 VEGF及其受體

VEGF是由二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，能與肝素結(jié)合，相對分子量34～45 KDa，NH2末端有特異的6個極性氨基酸組成的疏水基團(tuán)，是分泌信號的標(biāo)志。1983年，Senger等[1]從豚鼠的腹腔腫瘤中分離得到一種蛋白因子，發(fā)現(xiàn)它可以誘導(dǎo)血清蛋白由血管滲漏而不引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，稱為血管通透性因子（Vascular permeability factor，VPF）， 之后被認(rèn)為是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，在體內(nèi)有誘導(dǎo)血管生長、血管形成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，增加血管通透性的作用。人的VEGF基因位于染色體6p21，基因全長28 Kb，編碼基因長14 Kb，由8個外顯子及7個內(nèi)含子構(gòu)成[2]。編碼產(chǎn)物為同源二聚體糖蛋白，等電點(diǎn)為8.5，有很強(qiáng)的耐熱和耐酸能力。

VEGF是血小板衍生性生長因子（PDGF）家族的成員，其結(jié)構(gòu)與PDGF-β鏈部分相同，有18%序列相符。PDGF/VEGF家族成員的共同結(jié)構(gòu)是8個保守的被間隔的半胱氨酸殘基位于核心結(jié)構(gòu)，通過8個保守的半胱氨酸的第二和第四之間的二硫鍵形成同源二聚體，這些結(jié)構(gòu)對二聚化和生物活性至關(guān)重要。VEGF是一種多功能的細(xì)胞因子，可由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和一些間質(zhì)細(xì)胞分泌。

已發(fā)現(xiàn) VEGF 家族包括 7 個成員，VEGF-A、B、C、D、E、F[3]和 PIGF（Placeta Growth Factor，胎盤生長因子）[4]。 VEGF-A 發(fā)現(xiàn)最早，在組織和細(xì)胞中含量最豐富，功能最強(qiáng)，故多數(shù)文獻(xiàn)中的VEGF即指VEGF-A，它是以二硫鍵相連的寡二聚體糖蛋白，經(jīng)不同剪切方式可以7種不同的亞型出現(xiàn)，即VEGF121、145、165、183、189和206。 VEGF165是最主要的同分異構(gòu)體[5]。各亞型與肝素的結(jié)合能力、生理活性和作用各不相同[3]。VEGF121不與肝素結(jié)合，為可溶性分泌蛋白，分泌后較彌散；VEGF165的50%以分泌型存在，其余則與包膜上含硫酸乙酰肝素的蛋白多糖結(jié)合，具有很強(qiáng)的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖能力，在實(shí)驗(yàn)和臨床中研究較多。各種VEGF亞型中VEGF165便于肌注和靜脈注射，一方面是因?yàn)榫哂锌扇苄?，另一方面它可與蛋白多糖結(jié)合，作用時間較長，且誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性最強(qiáng)。VEGF-B基因定位于染色體11q13，主要在心肌等組織中表達(dá)，并且分布于絕大部分腫瘤中[6]。VEGF-C基因定位于染色體4q34，主要在心臟、胎盤等組織中表達(dá)，VEGF-B、C被認(rèn)為與淋巴管的發(fā)育有關(guān)，腫瘤細(xì)胞特異性的表達(dá)2.4 KDa的VEGF-C mRNA，可能與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。VEGF-D基因定位于染色體Xp22.31，全長50 Kb，由6個內(nèi)含子和7個外顯子組成。VEGF-D經(jīng)過與VEGF-C相同的方式被水解成一種成熟形式分泌出來。主要在心、肺、腸道表達(dá)，促內(nèi)皮分裂作用較弱。VEGF-E由149個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)與VEGF121相似，缺乏堿性區(qū)與肝素結(jié)合區(qū)[7]。PIGF基因定位于染色體2p16～21，有PIGF-1和PIGF-2異構(gòu)體，目前研究較少。

血管內(nèi)皮生長因子受體（Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）是VEGF特異性的膜受體，具有高親和力，屬于酪氨酸激酶亞家族中的一個成員。作為一種典型跨膜鑲嵌蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)及膜內(nèi)區(qū)3部分，以胞外7個免疫球蛋白樣的超二級結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)2個間開的酪氨酸激酶區(qū)為其特征。VEGF家族受體有：①Fam樣酪氨酸激酶受體（Flt-1/VEGFR-1），主要與內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及調(diào)節(jié)有關(guān)[8]；②激酶插入域或胎肝激酶受體（KDR/Flk-1/VEGFR-2），主要調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖及血管通透，主要參與血管形成過程[9]；③VEGFR-3/Flt-4，激活該受體主要引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生。

2 VEGF及其受體的表達(dá)

盡管在健康的器官中一般沒有血管增殖，但VEGF起著維持原有血管密度，以及維持所必需的通透性而運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的作用。VEGF基因的表達(dá)受缺氧、多種細(xì)胞因子，類固醇激素，瘤基因，抑瘤基因產(chǎn)物及一些小分子物質(zhì)等因素的調(diào)控。目前認(rèn)為，缺血或缺氧是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的最主要因素，VEGF能隨氧濃度的變化迅速上調(diào)達(dá)10倍以上。VEGF可表達(dá)于成纖維細(xì)胞、角朊細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，其主要生物學(xué)功能就是促進(jìn)血管形成。VEGF在成熟器官中表達(dá)較低，在一些代謝旺盛、血供豐富的組織細(xì)胞中，如腎小球足突細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、精子細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞等，VEGF的表達(dá)較高。

VEGF與組織器官的發(fā)育密切相關(guān)。胚胎組織、胎盤、增殖期的子宮內(nèi)膜、黃體等，由于生長發(fā)育和血管生成的需要，VEGF的表達(dá)呈較高水平[10]。對生理過程的影響主要體現(xiàn)在雌性的月經(jīng)周期變化中對子宮內(nèi)膜修復(fù)，及其在卵巢和黃體生成過程中對生育功能的影響。

VEGF在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷愈合、牛皮癬、遲發(fā)性過敏反應(yīng)和增生性瘢痕、瘢痕疙瘩等病理過程中可過量表達(dá)[11]。瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成與角朊細(xì)胞中VEGF過度表達(dá)或許有密切關(guān)系，其機(jī)制可能是VEGF通過旁分泌機(jī)制作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在真皮內(nèi)誘導(dǎo)生成大量新生血管，并能通過某種機(jī)制調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的活性[12]，影響膠原代謝。同時，組織的缺氧也可刺激細(xì)胞分泌VEGF[13]。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移需要得到充足的營養(yǎng)物質(zhì)，故而對血管生成具有特異性促進(jìn)作用的VEGF成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。研究表明，VEGF參與了體內(nèi)的特異性與非特異性炎癥反應(yīng)，并成為與視網(wǎng)膜新血管和視網(wǎng)膜病變相關(guān)的重要因子。

VEGFR主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其他細(xì)胞中也可表達(dá)其中一種或兩種受體。除VEGFR-3分布于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞外，VEGFR-1、VEGFR-2主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。VEGFR-1能在腎小球系膜細(xì)胞、單核細(xì)胞以及滋養(yǎng)層細(xì)胞等處表達(dá)；而造血干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞則能表達(dá)VEGFR-2。這兩種受體均具有酪氨酸激酶活性，與VEGF結(jié)合具有特異性。正常組織中VEGFR一般呈低表達(dá)，但在特殊的生理及病理過程中，VEGFR可表達(dá)上調(diào)，如腫瘤或創(chuàng)傷等。在月經(jīng)周期，VEGFR表達(dá)也可增高。在許多種腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中其表達(dá)均可上調(diào).應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，在卵巢癌和黑色素瘤細(xì)胞中測到KDR mRNA，提示VEGFR也可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，VEGF可通過旁分泌及自分泌途徑作用于腫瘤細(xì)胞受體。

3 VEGF表達(dá)的調(diào)控因素

VEGF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚，一些細(xì)胞因子對VEGF的表達(dá)有正調(diào)節(jié)作用[14]。同時，缺氧狀態(tài)可以誘導(dǎo)刺激VEGF的表達(dá)。此外，蛋白激酶C、雌激素腺苷酸環(huán)化酶激活劑，以及雙氧水、紫外線也可誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF[15]。

3.1 細(xì)胞因子

腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β、血小板源性生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、白細(xì)胞介素-1、表皮生長因子、前列腺素E等，均能使VEGF及其受體表達(dá)上調(diào)，提高其生物學(xué)活性[16]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，bFGF和VEGF聯(lián)合使用，會明顯提高血管再生的速度及生成血管的直徑，同時大大提高了缺血肢體的血供[17]。TNF-α能使體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移和管狀生長，但較低的劑量有明顯的促進(jìn)血管生成的作用，而高劑量時則表現(xiàn)為抑制作用。把神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和TNFα一起培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，VEGF和VEGF基因啟動子SP-1區(qū)的RNA表達(dá)增高，其增高幅度為單獨(dú)孵化神經(jīng)膠質(zhì)瘤的5倍，證明TNFα的血管生成作用還和激活VEGF基因啟動子sp-1區(qū)有關(guān)。

3.2 缺氧

缺氧條件下機(jī)體組織VEGF表達(dá)上調(diào)，VEGF合成增多，其作用機(jī)制可能為：①缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）誘導(dǎo)啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄，HIF-1受氧氣和生長因子的調(diào)節(jié)，可以激活正常的缺氧感受基因，HIF-1可以在數(shù)分鐘內(nèi)使VEGF增加30倍，從而調(diào)控VEGF表達(dá)[18]；②在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)及mRNA水平明顯增高，提示缺氧可導(dǎo)致VEGF的表達(dá)及釋放，并且是促血管生成的因素之一[19]。③缺氧使得一種核內(nèi)核糖蛋白與VEGF mRNA非翻譯區(qū)的富含Au元件形成RNA-蛋白復(fù)合物，可顯著延長VEGF mRNA在體內(nèi)的半衰期，從而間接提高VEGF的生理活性[20]。

3.3 血小板

血小板在VEGF的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)中起重要作用。將人血小板和凝血酶在體外孵化，發(fā)現(xiàn)有大量VEGF產(chǎn)生?；罨难“迥茚尫臯EGF，這對創(chuàng)傷愈合及其他病理?xiàng)l件下的血管形成具有重要意義。研究認(rèn)為，血小板和損傷的血管壁接觸可激發(fā)凝血機(jī)制，導(dǎo)致VEGF釋放。另外，Salgado等[21]在對惡性腫瘤的血液標(biāo)本檢測時發(fā)現(xiàn)，VEGF濃度是正常的3.2倍，這一結(jié)果支持血小板具備儲存有生物活性的VEGF的作用。

3.4 其他

一些原癌基因和抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，以及類固醇激素、交感神經(jīng)也可以調(diào)控VEGF的表達(dá)，如促甲狀腺激素可通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞合成、分泌VEGF；野生型p53基因通過與轉(zhuǎn)錄因子SP-1結(jié)合，可下調(diào)內(nèi)源性VEGF mRNA，并抑制VEGF啟動子活性，而重組p53基因無此作用。

4 VEGF生物學(xué)作用

4.1 促進(jìn)血管生成作用

VEGF最主要的生物學(xué)作用是可以促進(jìn)動脈、靜脈，以及淋巴管來源的內(nèi)皮細(xì)胞的生長[22]。自身內(nèi)源性的VEGF是機(jī)體組織損傷恢復(fù)重要的血管生長因子，Wagatsuma[23]通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肌肉損傷后早期VEGF及其受體的mRNA表達(dá)明顯增高，與損傷早期的血管化程度密切相關(guān)，從而也間接說明了VEGF的重要的血管化作用。治療性血管生長素是治療缺血性血管疾病的一個新概念，它包括誘導(dǎo)血管發(fā)生、小動脈生成及淋巴管生成[24]。在血管生長中，VEGF調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞胞外基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生和管腔形成。其過程主要包括以下步驟[25]：①血漿的外滲，新生血管外基質(zhì)的構(gòu)筑；②新生血管芽雛形的形成；③血管芽的發(fā)育和擴(kuò)展；④新生血管的成熟和改建。VEGF通過增加血管通透性，使血管內(nèi)纖維蛋白原等血漿蛋白外滲，纖維蛋白原與血管外滲纖維連接蛋白等多種成分凝結(jié)形成交叉的纖維蛋白凝膠體，為內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的遷移提供一個纖維網(wǎng)絡(luò)，有利于血管生成。VEGF在多種在體模型中的促血管生成作用已經(jīng)被多個實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[26]。此外，還有許多的體外和在體實(shí)驗(yàn)表明，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存因子，Maharaj等[27]認(rèn)為低水平生理量的VEGF-A是維持血管穩(wěn)定所必需的。在體外實(shí)驗(yàn)中，Gerber等[28]發(fā)現(xiàn)VEGF是通過PI-3激酶-Akt通路發(fā)揮抗凋亡作用的；VEGF可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Bcl-2，Bcl-A1等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而起到抗凋亡作用。體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合后，可立即引起鈣離子內(nèi)流。數(shù)秒內(nèi)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高4倍以上，并且刺激三磷酸肌醇的累積，表明其通過激活磷脂酶C而起作用[29]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，VEGF對于機(jī)體的發(fā)育也是必不可少的，如抑制VEGF的作用，可以使新生鼠的血管發(fā)生顯著的凋亡改變，而成年鼠則沒有類似改變。Benjamin等[30]對腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，新形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF具有強(qiáng)烈的依賴性，而已經(jīng)存在的、成熟的血管對VEGF的依賴性則較弱；認(rèn)為這種依賴性下降的主要原因是由于外皮細(xì)胞或周細(xì)胞的覆蓋所致。

4.2 提高血管通透性

VEGF增加毛細(xì)血管后靜脈和小靜脈的通透性，主要作用于毛細(xì)血管后靜脈，在幾分鐘內(nèi)即可增加血管對血漿蛋白的通透性，在已知的微血管通透性誘導(dǎo)物中作用最強(qiáng)，效應(yīng)是組織胺的5萬倍。通過超微免疫組化定位后發(fā)現(xiàn)，VEGF結(jié)合在微血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔外側(cè)面和一種被稱為囊-泡小體（VVO）的細(xì)胞器上[31]。VVO橫跨在內(nèi)皮細(xì)胞管腔的內(nèi)側(cè)面至外側(cè)面，是內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中一些囊、液泡組成的葡萄簇樣結(jié)構(gòu)。囊、液泡直接由三層單位膜相連，此外還有一個由隔膜組成的可開閉的小孔。當(dāng)孔打開時，血液中的大分子物質(zhì)從相互連接的囊泡液中通過，進(jìn)入周圍的組織間隙中。血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜面和VVO中有結(jié)合的VEGF，局部注射VEGF后可觀察到VVO的功能增強(qiáng)[32]。VEGF引起血管通透性增加，導(dǎo)致血漿蛋白廣泛的外漏，其中包括凝血因子、纖維蛋白原、纖維黏連蛋白、血漿酶原等[33]。這些蛋白直接或間接改變了細(xì)胞外基質(zhì)成分，使其形成暫時性的新基質(zhì)，允許并支持內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)向移動，遷移到成纖維細(xì)胞合成和分泌基質(zhì)蛋白、蛋白聚糖，內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管，共同構(gòu)成新生肉芽組織，修復(fù)創(chuàng)傷。

4.3 其他作用

雖然血管內(nèi)皮細(xì)胞是VEGF發(fā)揮作用的主要靶細(xì)胞，但是VEGF也可以作用于其他一些細(xì)胞并發(fā)揮促有絲分裂作用，例如：肺泡Ⅱ型細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等。此外，VEGF對骨髓來源的細(xì)胞也有一定的作用，它能提高單核細(xì)胞的趨化性，并通過誘導(dǎo)桿狀核-巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的成熟使克隆形成。此外，VEGF在視網(wǎng)膜血管新生、老年斑退化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及牛皮癬發(fā)生中均有重要作用[34]。

5 VEGF在創(chuàng)傷愈合中的表達(dá)

創(chuàng)傷愈合的關(guān)鍵就是血管生成，已經(jīng)證實(shí)VEGF是最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原。VEGF作為血管生成的一個重要的調(diào)節(jié)因素，在創(chuàng)傷愈合研究中占據(jù)著特殊的地位。VEGF在正常組織的表達(dá)一般較微弱，但在創(chuàng)傷愈合中會有較強(qiáng)的表達(dá)。

Corral等[35]對兔耳缺血模型的研究發(fā)現(xiàn)，缺血皮膚及缺血創(chuàng)面VEGF mRNA表達(dá)均上調(diào)，且從損傷后第1天起直至第10天。對大鼠創(chuàng)傷皮膚內(nèi)VEGF表達(dá)的免疫組化研究表明，創(chuàng)傷組于傷后12 h VEGF表達(dá)開始增強(qiáng)，以24～48 h表達(dá)最強(qiáng)。24～48 h VEGF除在上皮細(xì)胞表達(dá)外，在巨噬細(xì)胞及新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽性表達(dá)。48 h后血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)漸弱。對急性放射性潰瘍的研究證實(shí)，輻射損傷的皮膚組織細(xì)胞合成分泌VEGF的功能，在潰瘍形成前被電離輻射輕度激活，但在潰瘍形成后，在輻射和創(chuàng)面的雙重刺激下，明顯低于單純創(chuàng)面，不能形成峰值，是潰瘍形成、發(fā)展及難以愈合的原因之一。

應(yīng)當(dāng)指出，僅考慮VEGF的促血管生成作用還不足以完全解釋缺血創(chuàng)面應(yīng)用外源性VEGF后肉芽組織的快速生長，因?yàn)閎FGF也有較明顯的促血管生成作用，但在缺血創(chuàng)面的應(yīng)用中無明顯效果。VEGF還能增加微血管通透性，促進(jìn)血漿蛋白滲出及細(xì)胞遷移至損傷區(qū)域，而bFGF則無此特性[36]。另外，VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合后會釋放許多具有生物學(xué)活性的生長因子及細(xì)胞因子，而bFGF不能。在缺血創(chuàng)面愈合中，VEGF165作用較VEGF121更為突出。VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚，但一些血清來源和旁分泌的生長因子與細(xì)胞因子， 包括 PDGF、EGF、TNF、TGF等都能使培養(yǎng)細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)3～20倍，而創(chuàng)傷修復(fù)各階段均有上述因子的表達(dá)。其中，bFGF具有直接調(diào)節(jié)作用，并且與VEGF協(xié)同作用明顯[37]。創(chuàng)傷早期階段的局部組織缺氧，對調(diào)節(jié)創(chuàng)面VEGF的表達(dá)具有重要作用。

綜上所述，作為體內(nèi)的最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成的因子，VEGF在創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、視網(wǎng)膜血管新生、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中都起著重要的作用，同時，很多因素也影響著VEGF的表達(dá)和發(fā)揮作用。因此，進(jìn)一步研究VEGF及其影響因素和調(diào)控機(jī)制，尋找特異性和靶向性強(qiáng)的目的基因和藥物，在血管性疾病的治療中具有重要的意義。

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