內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑與重編程功能性心肌干細(xì)胞

汪進(jìn)益 綜述 范慧敏 劉中民 審校

干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)被視為繼藥物治療和外科手術(shù)后的第三代治療方法，在器官發(fā)育和組織修復(fù)中已凸現(xiàn)出非常重要的地位。然而，目前干細(xì)胞研究仍處于探索的早期階段，干細(xì)胞在發(fā)育、疾病和再生等方面的分子水平機(jī)制尚未闡明[1]。當(dāng)今生物學(xué)關(guān)于體細(xì)胞重編程（Reprogramme）及細(xì)胞核潛在全能性的熱點(diǎn)研究，即誘導(dǎo)式多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）技術(shù)，對(duì)再生醫(yī)學(xué)和體外疾病模型的研究具有潛在的重要意義[2－3]，如從人類iPSCs可以產(chǎn)生“功能性心肌干細(xì)胞”（Functional cardiomyocytes），作為新生組織的來(lái)源而實(shí)現(xiàn)心肌再生[4]。但誘導(dǎo)產(chǎn)生iPSCs的效率低下，且重編程不完全，必須依賴轉(zhuǎn)基因的外源因子的持續(xù)表達(dá)[5]；利用病毒轉(zhuǎn)基因（尤其是癌基因c-Myc和Klf4）在體細(xì)胞基因組內(nèi)整合后存在致癌危險(xiǎn)[2，5]，從而限制了iPSCs在基礎(chǔ)研究、藥物篩選、毒理學(xué)及再生醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用[6-8]。有些學(xué)者認(rèn)為，重編程后的細(xì)胞是否具有全能性，并不是必須的，一個(gè)具有一定分化能力，但是這種分化能力并非無(wú)限制的狀態(tài)可能更為安全和有效[9]。鑒于每種細(xì)胞都表達(dá)著一些決定它們分化狀態(tài)的基因，這一特征在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中尤其明顯[10]。因此，鎖定在“單一多能性”或者“寡多能性”（只能產(chǎn)生一種或幾種細(xì)胞類型）的目標(biāo)，通過(guò)外源表達(dá)基因進(jìn)行體細(xì)胞重編程，轉(zhuǎn)換與所需細(xì)胞類型相近的一種正常細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生所需的細(xì)胞類型（特定組織的功能性細(xì)胞）[11－12]，進(jìn)而探索這些重編程干細(xì)胞在體內(nèi)和體外增殖、分化及調(diào)控等微環(huán)境方面的基礎(chǔ)性研究，對(duì)深入研究干細(xì)胞分子機(jī)制更具有重要的實(shí)用意義。

1 重編程“功能性心肌細(xì)胞”

利用外源表達(dá)基因在轉(zhuǎn)錄因子激活或抑制的相互平衡條件下進(jìn)行體細(xì)胞重編程，轉(zhuǎn)換為與所需細(xì)胞類型相近的一種正常細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生所需的細(xì)胞類型[11-12]，并在一定誘導(dǎo)條件下（微環(huán)境）向特異性組織細(xì)胞（如心肌細(xì)胞）定向分化，而不是將細(xì)胞先轉(zhuǎn)變成全能性的狀態(tài)再?gòu)囊粋€(gè)很大的范圍來(lái)縮小它們的分化道路，令重編程細(xì)胞的治療性使用更加安全和接近現(xiàn)實(shí)。迄今為止，重編程細(xì)胞的產(chǎn)生均通過(guò)重編程因子的核酸運(yùn)載系統(tǒng)（如采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、組成型的慢病毒載體及可誘導(dǎo)的慢病毒載體）獲得。因?yàn)橛雄E象表明，基因組的插入可能影響基因功能[13]，而病毒基因的重新激活則有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]，因此整合型病毒僅適合于機(jī)理研究[14－15]。對(duì)整合位點(diǎn)的分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)共同的靶標(biāo)和通路，這表明重編程過(guò)程中基因組的整合并不是必需的[16-17]。Zhou等[18]用腺病毒轉(zhuǎn)入三個(gè)通常為胰島β細(xì)胞分化所需的轉(zhuǎn)錄因子(Pdx1、Ngn3和MafA)后，將20%的成功轉(zhuǎn)染的外分泌細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生胰島素的內(nèi)分泌β細(xì)胞。攜帶外源基因的腺病毒不必整合到外分泌細(xì)胞的基因組當(dāng)中，品系轉(zhuǎn)變并不需要細(xì)胞分裂，并且對(duì)外源基因表達(dá)的需求也是暫時(shí)的，為細(xì)胞的定向分化提供一條現(xiàn)實(shí)的可行性策略。因此，腺病毒轉(zhuǎn)運(yùn)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成功運(yùn)用于細(xì)胞的重編程，使得最終運(yùn)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)方法獲取重編程干細(xì)胞成為可能[19-21]。此外，選擇用何種組織細(xì)胞制備干細(xì)胞，主要是出于組織獲取途徑的安全性和可重復(fù)性，以及細(xì)胞重編程效率的考慮[22]。這就要求應(yīng)用研究的重編程干細(xì)胞需要供體細(xì)胞具備容易獲取、含有較少的遺傳紊亂和容易被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法重編程的特點(diǎn)[21]。由于分離成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)B）在技術(shù)上十分簡(jiǎn)便[23]，獲取容易，不僅可以與胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件兼容，還可以用作胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞。因此，F(xiàn)B目前依舊是研究重編程過(guò)程機(jī)制時(shí)基礎(chǔ)研究的首選。運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和基因工程相結(jié)合的技術(shù)，通過(guò)肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 （Myogenic determination，MyoD）和連接蛋白 43（Connexin 43，Cx43）基因誘導(dǎo)分化，將FB改造成為具有縫隙連接介導(dǎo)細(xì)胞間通訊 （Gap junctional intercellular communication，GJIC）功能的可興奮細(xì)胞的“心肌樣”細(xì)胞（功能性心肌細(xì)胞）是可行的。

2 內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑系統(tǒng)的作用

無(wú)論在體內(nèi)還是體外，細(xì)胞通常都是處于一種異質(zhì)性（Heterogeneous）的環(huán)境當(dāng)中，在移植之后會(huì)發(fā)生聚集和遷移，還會(huì)與宿主系統(tǒng)（如局部微環(huán)境和免疫系統(tǒng)等）發(fā)生相互作用[18]。因此，植入細(xì)胞所處的微環(huán)境具有重要作用[24]。臨床應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞所處的微環(huán)境往往都是病理狀態(tài)下的微環(huán)境，也可能是處于免疫抑制狀態(tài)下的微環(huán)境。急性心肌梗死時(shí)，活性氧化物（Reactive oxygen species，ROS）增高導(dǎo)致梗死心肌內(nèi)環(huán)境處于持續(xù)氧化應(yīng)激狀態(tài)，內(nèi)因性血管形成能力低下，即使移植有可能向心肌細(xì)胞分化的干細(xì)胞也難以期待其功能的顯著恢復(fù)，干細(xì)胞移植入梗死心肌后存活率低，限制了其改善心肌梗死后的心功能和促進(jìn)新血管生成（Angiogenesis）的作用。探討干細(xì)胞在體內(nèi)和體外增殖、定向分化的微環(huán)境調(diào)控因素及其作用機(jī)制的理論，對(duì)實(shí)現(xiàn)高效地將重編程干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞，并應(yīng)用到心肌再生具有重要的理論價(jià)值?；瘜W(xué)修飾小分子調(diào)節(jié)劑、轉(zhuǎn)錄因子及輔助因子等應(yīng)答發(fā)育或環(huán)境信號(hào)來(lái)控制細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的定向分化[25－26]，形成可供臨床使用的重編程體細(xì)胞[1]。已有的研究證實(shí)，小分子化學(xué)物質(zhì)一氧化氮（Nitric oxide，NO）是由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）以左旋精氨酸（Larginine，L-arg）和分子氧為底物形成，在心肌梗死后心室重構(gòu)與心力衰竭的病理生理進(jìn)程中起重要作用[27]。Long等[28]報(bào)道，外源性L-arg的補(bǔ)給可以影響內(nèi)皮細(xì)胞NOS活性，促進(jìn)內(nèi)源性NO的生成，對(duì)成肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和融合（肌管形成）發(fā)揮直接作用，而這一作用可被NOS抑制劑亞硝酸左旋精氨酸甲酯 （NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester，LNAME）阻斷。NOS增強(qiáng)劑（AVE9488）通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的NOS過(guò)表達(dá)和增加NO的合成，緩解血管舒縮功能障礙、超氧化物形成、增加循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞，達(dá)到改善心肌重構(gòu)和心功能的作用[29]。非對(duì)稱型左旋二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）是機(jī)體自身產(chǎn)生的NO合成底物L(fēng)-arg的類似物，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS的活性，使NO合成減少，被稱為內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑 （Endogenous inhibitor of nitric oxide synthase）。ADMA的代謝是經(jīng)二甲精氨酸-二甲賴氨 酸 水 解 酶 （Dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH）的作用生成二甲胺及L-瓜氨酸（較穩(wěn)定，測(cè)定其水平可以反應(yīng)DDAH的活性）[30]。DDAH的表達(dá)上調(diào)或活性增加均可使ADMA的代謝增強(qiáng)；反之，DDAH的表達(dá)下調(diào)或活性減弱使ADMA分解代謝減弱，使ADMA蓄積。雖然ADMA濃度升高的分子機(jī)制尚未完全闡明，但是仍有充分的證據(jù)表明ADMA可通過(guò)下調(diào)Cx43基因的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞之間GJIC的功能[31]；機(jī)體ADMA水平的減少可以促進(jìn)骨髓源內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)員，加速血管的形成[32]。研究表明，內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑系統(tǒng) （ADMA/DDAH途徑）是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞能動(dòng)性和血管生成的決定性因素，其中其改變NO信號(hào)和Rho GTPases酶（肌動(dòng)蛋白活性的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子）活性是核心作用[33-35]。因此，內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制劑系統(tǒng)（ADMA/DDAH）不但在體內(nèi)外調(diào)控血管生成中起著關(guān)鍵性作用，而且對(duì)肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和促進(jìn)肌生成方面發(fā)揮重要作用。所以，通過(guò)藥物等方式調(diào)節(jié)ADMA濃度是心血管疾病的一個(gè)新的治療目標(biāo)，需要進(jìn)一步研究其生理和病理生理作用及機(jī)制。

綜上所述，探索研究ADMA/DDAH系統(tǒng)對(duì)重編程獲得的“功能性心肌細(xì)胞”之間、宿主心肌組織內(nèi)及其與血管內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的可塑性（心肌定向分化）干預(yù)作用，可以豐富移植細(xì)胞與微環(huán)境和諧共存下干細(xì)胞定向分化的分子機(jī)制。

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