胰島素樣生長因子和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白在軟骨細胞生長和發(fā)育過程中的調(diào)控作用研究進展

劉瑾春 劉霞 綜述 曹誼林 審校

軟骨組織工程為臨床治療軟骨缺損提供了新的思路和方法，軟骨細胞是軟骨組織工程種子細胞的一個重要來源，應(yīng)用自體軟骨細胞構(gòu)建的組織工程軟骨可以成功修復(fù)大型哺乳動物關(guān)節(jié)承重面的缺損[1]。自體軟骨細胞移植術(shù)作為一種有效和成熟的技術(shù)已開始應(yīng)用于臨床[2]。在軟骨細胞培養(yǎng)過程中，尋找最佳的培養(yǎng)微環(huán)境，尤其是仿生微環(huán)境下生長和細胞因子的調(diào)控作用，對于軟骨組織工程的發(fā)展具有重要作用。在生理微環(huán)境中，許多生長因子參與了調(diào)控軟骨細胞的代謝[3]。胰島素樣生長因子 （Insulin-like growth factors，IGFs）是生長發(fā)育調(diào)控系統(tǒng)－生長激素－胰島素樣生長因子功能軸（GH-IGF-I軸）中重要的成員，在軟骨細胞生長和發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（Insulin-like growth factor-binding proteins，IGFBPs）是 IGF 最主要的功能和轉(zhuǎn)運的調(diào)控者。本文就IGFs和IGFBPs在軟骨組織發(fā)育中的作用進行綜述。

1 胰島素樣生長因子的特點

島素樣生長因子（IGFs）是由67～70個氨基酸組成的多單鏈肽，結(jié)構(gòu)上與胰島素相似，包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，它們作用于細胞表面胰島素樣生長因子受體1（IGF1R）和胰島素樣生長因子受體2（IGF2R）發(fā)揮作用。1957年，Salmon等[4]發(fā)現(xiàn)IGFs是體內(nèi)生長因子（GH）軸中重要的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子。它們通過自分泌和旁分泌方式，與循環(huán)中的IGF-Ⅰ共同調(diào)控多種組織細胞的增殖和分化[5]。多種組織器官能合成和分泌IGF-Ⅰ，但循環(huán)中的IGF-Ⅰ主要是由肝臟合成和分泌的。IGF-Ⅰ幾乎能促進機體的所有細胞生長，尤其是骨骼肌細胞、軟骨、皮膚、神經(jīng)、肝臟、腎臟、骨、造血細胞和肺臟。缺乏IGF-Ⅰ可以導(dǎo)致Laron綜合征（原發(fā)性生長激素不敏感綜合征），表現(xiàn)為血清生長激素（hGH）水平正常或高、胰島素樣生長因子（IGF-I）水平低下的家族性侏儒癥[6]。

2 IGF在軟骨發(fā)育和成熟中的作用

在生長因子（GH）的調(diào)控下，IGF-Ⅰ在長骨發(fā)育，即軟骨內(nèi)化骨的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7]。IGF-Ⅰ基因敲除小鼠的研究為IGF-Ⅰ生理功能的研究提供了重要手段。敲除IGF-Ⅰ的小鼠在宮內(nèi)出現(xiàn)生長延遲，只有5%的小鼠出生后可以存活，出生后出現(xiàn)異常的生長遲緩，成年時體型也只有野生型小鼠的 20%～30%[8]。

在骨骼發(fā)育初期，IGF-Ⅰ和IGFBP2共同在致密的間充質(zhì)干細胞聚集體核心表達，提示它們在軟骨內(nèi)化骨的初期具有調(diào)控作用[9]。在間充質(zhì)干細胞聚集階段，IGF-Ⅰ可以通過抑制程序性凋亡（降低激活型caspase3）增加間充質(zhì)干細胞生存率[10]；IGF-Ⅰ能誘導(dǎo)肢體胚芽聚集的間充質(zhì)干細胞向軟骨分化，表現(xiàn)為明顯的Ⅱ型膠原和硫酸化蛋白聚糖的聚集[11]，這種誘導(dǎo)作用是通過PI3K/Akt通路來實現(xiàn)的。在軟骨組織工程中，單獨低濃度TGF-β1（5 ng/mL）并不能誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSC）分化為明顯的軟骨組織，但是如果支架材料緩釋IGF-Ⅰ就可以形成明顯的的軟骨組織[12]。目前尚沒有證據(jù)證實IGF-Ⅰ能單獨誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞 （BMSC）成軟骨，提示IGF-Ⅰ在干細胞已經(jīng)成軟骨定向的情況下才具有顯著的成軟骨促進作用。

IGF-Ⅰ參與了成熟軟骨組織穩(wěn)態(tài)的保持。成體軟骨組織IGFSs的來源包括血液、關(guān)節(jié)液和軟骨細胞自分泌。IGF可以促進軟骨細胞的增殖，抑制各種原因誘導(dǎo)的軟骨細胞的凋亡。2000年，Richard等[13]應(yīng)用IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ蛋白抗體和反義RNA阻斷了IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ?qū)浌羌毎挠绊?，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的生存率降低了18%～28%，如果阻斷IGFs受體后生存率更降低了45%，這種作用佐證了IGF對促進生長板生長的重要作用。IGFs對于不同階段的軟骨細胞的促進增殖作用不同，Lindahl等[14]觀察了IGF-I對軟骨的3個層次（對應(yīng)幼稚期，增殖期和肥大軟骨細胞）軟骨細胞克隆形成的影響，發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ可以增加幼稚軟骨細胞和增殖期軟骨細胞克隆形成率，而對遠端層細胞的克隆形成率沒有影響。IGF可以促進軟骨細胞表型的維持,可以抑制軟骨細胞去分化，促進再分化[15]，保持軟骨細胞的特異表型并且抑制了程序性凋亡[10]。IGF可以促進軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)[16]。研究顯示胎牛血清在軟骨組織培養(yǎng)中刺激組織合成糖胺多糖的作用主要是IGF-Ⅰ的作用，阻斷了IGF-Ⅰ后血清的刺激軟骨組織產(chǎn)生糖胺多糖的作用也消失了[17]。

3 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白的特點

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 （Insulin-like growth factorbinding proteins，IGFBPs）代表了一個能與 IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ相結(jié)合的進化上保守的蛋白質(zhì)家族。一般認為這個家族包括6 個高親和力 IGF 結(jié)合蛋白 （IGFBP1、2、3、4、5、6）和至少 4個低親和力的 IGFBP 相關(guān)蛋白質(zhì)（IGFBP-rP1、2、3、4）。 家族成員 IGFBP1、2、3、4、5、6，結(jié)構(gòu)高度同源，功能相似，但在表達特點和對IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的親和性方面卻各有不同[18]。這些結(jié)合蛋白廣泛分布于體液和組織中，即使在低等動物中也保守存在，提示這個蛋白家族可能具有重要的作用[19]。但是轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)方面的研究顯示，過表達IGFBP-3以及敲除IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4對小鼠表型沒有明顯影響[20－21]，又讓人們對IGFBP的作用產(chǎn)生了疑問。

每個IGFBP蛋白質(zhì)家族成員大約有216～289個氨基酸，蛋白質(zhì)的C端和N端的結(jié)構(gòu)在家族成員間是高度保守的，而中間部分的變化比較大，家族成員間的相似性在47%～60%之間[19]。位于C端和N端的半胱氨酸對于形成分子口袋樣的二級結(jié)構(gòu)，從而保證與IGF緊密結(jié)合是非常重要的[22]。這些蛋白對IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的結(jié)合力基本相當(dāng)，僅有IGFBP-6對IGF-Ⅰ結(jié)合力較低，而對IGF-Ⅱ的結(jié)合力較高[23]。新發(fā)現(xiàn)的4 個 IGFBP 相關(guān)蛋白質(zhì)（IGFBP-RP1、2、3、4）與 IGFBP 有相似的一級和二級IGF結(jié)構(gòu)，它們對IGF的親和力僅為前述的6個IGFBPs親和力的1%，肽鏈C端的結(jié)構(gòu)差異影響了它們的結(jié)合力。如此低的結(jié)合力提示IGF結(jié)合的作用在生理情況下可能并不重要，更重要的是獨立于IGF的作用。

IGFBPs通過與IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ結(jié)合，減少IGF與其相應(yīng)的受體相結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)控作用，而IGFBPs具有對抗細胞增殖的作用。體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，IGFBP2、IGFBP4、IGFBP6主要起到抑制IGFs的作用，IGFBP5則起到加強的作用，而IGFBP1、IGFBP3則視培養(yǎng)細胞或培養(yǎng)條件的不同而起到抑制或加強的作用[24－25]。不同的組織和體液中，IGFBPs種類的濃度是有差異的，血漿中IGFBP3是含量最高的結(jié)合蛋白。

IGFBPs是儲存和轉(zhuǎn)運IGFs的主要形式。在血漿中，IGFs主要以一個150～200 KDa三聚體的形式存在，這個三聚體包括IGFs、IGFBP3和一個100 KDa不耐酸的亞基，在這種情況下IGFs的半衰期有游離狀態(tài)下的約10 min增至三聚體狀態(tài)下的 12～15 h[26]，所以IGFBP3是 IGFs在血漿中的主要儲存方式[27]，在酸性環(huán)境中這個三聚體會自然解聚，IGFs被釋放出來。另有小部分IGFs與IGFBP1、IGFBP2和其他小分子量結(jié)合蛋白結(jié)合，有0.5%～2%的IGFs游離存在[28]。當(dāng)組織需要IGFs的時候，IGFBP3在蛋白水解酶的作用下釋放IGFs，后者通過血管壁進入組織。IGFBPs還具有將IGFs運送到細胞表面受體的作用。IGFBP1和IGFBP3均有促進配體到受體之間的運輸?shù)淖饔?。IGFBP1和IGFBP3在細胞表面均有結(jié)合位點，其中就包括Ⅴ型TGF－β受體[29]。

4 IGFBPs在軟骨發(fā)育中的調(diào)控作用

在軟骨的發(fā)育過程中，IGF-Ⅰ促進細胞外軟骨基質(zhì)的表達，而IGFBP2則抑制這種表達[9]。另外一個研究同樣發(fā)現(xiàn)，在雞胚胎的前肢過表達IGFBP2導(dǎo)致了胚胎前肢發(fā)育的明顯的縮短，說明IGFBP2抑制了軟骨細胞和軟骨膜、骨膜細胞的增殖并抑制了成軟骨過程，這種作用又是通過阻斷IGF-I和IGF-II實現(xiàn)的[30]。但是，對于IGFBP3的研究則發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)論。對斑馬魚胚胎咽弓軟骨的研究發(fā)現(xiàn)，如果在發(fā)育過程中阻斷IGFBP3的表達，咽弓軟骨和內(nèi)耳就會出現(xiàn)明顯的發(fā)育遲緩，糾正IGFBP3的表達，這種表型仍舊可以恢復(fù)正常[31]，提示IGFBP3在咽弓軟骨和內(nèi)耳的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。此前人們認為IGFBPs具有抑制IGFs的作用，而這個研究發(fā)現(xiàn)阻斷IGFBP3也出現(xiàn)發(fā)育遲緩的表型，提示IGFBP3和IGFs在軟骨發(fā)育過程中具有協(xié)同作用，而不是相反的作用。在另一個生長板模型的研究中發(fā)現(xiàn)，IGFBP5在向軟骨分化過程中表達顯著上調(diào),過表達IGFBP5并不能單獨促進軟骨的分化，但是可以加強IGF-Ⅰ的促進軟骨分化的作用[32]。所以，對IGFBPs對軟骨發(fā)育的作用目前仍存在不明確的地方，需要進一步的研究和探討。

在成熟軟骨方面，IGFBP2在軟骨前肥大細胞層和肥大細胞層表達，提示它在軟骨細胞的成熟過程具有調(diào)節(jié)作用[9]。對牛新鮮關(guān)節(jié)軟骨組織的蛋白提取物進行的蛋白印跡研究顯示，關(guān)節(jié)軟骨組織包含IGFBP2和IGFBP6，其中以后者為主，應(yīng)用TGFβ刺激培養(yǎng)的軟骨可以增加IGFBP2的分泌，但是IGFBP6不受影響，而IGF-Ⅰ的刺激作用相似，只是程度較輕，同樣IGFBP2似乎起到了抑制IGFs進而抑制蛋白多糖合成的作用[33]。針對人的正常軟骨和骨關(guān)節(jié)炎軟骨的IGFBPs研究中，除了發(fā)現(xiàn)IGFBP2和少量IGFBP4外，還發(fā)現(xiàn)了IGFBP3，而且隨著骨關(guān)節(jié)炎病變的加重，IGFBP3的含量也增高[33]。在體外單層培養(yǎng)生長板增殖層的關(guān)節(jié)軟骨細胞發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞分泌IGFBP2、IGFBP4、 IGFBP5和豐度較低的IGFBP3、IGFBP6[34]，用 IGFs 刺激后表達 IGFBP-3、IGFBP-2、IGFBP-5會增加，用TGF－β刺激后也可以引起IGFBP-3、IGFBP-2、IGFBP-5表達增加，提示這些結(jié)合蛋白在軟骨生長板處的自分泌、旁分泌受到這些生長因子的調(diào)控。另外IGFBPs似乎參與了骨關(guān)節(jié)炎的病理生理過程。在慢性骨關(guān)節(jié)患者中，應(yīng)用原位雜交和免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下的軟骨細胞分泌的IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5均明顯升高，同時升高的有IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ受體[35]。IGFBP3、4、5的升高程度與關(guān)節(jié)炎的組織學(xué)改變呈現(xiàn)正相關(guān)，提示了它們可能在慢性骨關(guān)節(jié)炎的病理機制中發(fā)揮作用[33]。

5 結(jié)語

胰島素樣生長因子（IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）是細胞增殖和分化的重要的調(diào)控因子，對于軟骨組織的生長和發(fā)育不可或缺。IGFBPs是IGF最主要的功能和轉(zhuǎn)運的調(diào)控者。揭示IGFs、IGFBPs和它們的靶細胞之間的關(guān)系有助于我們理解生物體生長和發(fā)育的規(guī)律，同時通過調(diào)控IGFs、IGFBPs系統(tǒng)可能為軟骨組織工程和某些疾病的治療提供新的思路。

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