果糖和麥芽糖作為有氧碳源對大腸桿菌NZN111兩階段發(fā)酵中厭氧發(fā)酵的影響

吳輝，李志敏，葉勤

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237

大腸桿菌NZN111是大腸桿菌W1485的丙酮酸甲酸裂解酶 (PFL) 和乳酸脫氫酶 (LDH) 雙突變株。文獻報道即使在復(fù)合培養(yǎng)基中添加了乙酸鹽它也不能在厭氧條件下代謝葡萄糖進行生長[1-2]，普遍認為這是由于NZN111缺失了消耗NADH的乳酸脫氫酶以及為乙醇合成提供前體乙酰輔酶A (Ac-CoA)的丙酮酸甲酸裂解酶，整個厭氧代謝的氧化還原系統(tǒng)平衡遭到破壞，細胞不能夠有效氧化葡萄糖經(jīng)糖酵解 (EMP) 途徑產(chǎn)生的 NADH，導(dǎo)致了胞內(nèi)不尋常高的 NADH/NAD+比例，從而導(dǎo)致代謝的停滯。NZN111表達LDH改善了NADH消耗，NAD的生成使EMP途徑能夠運行[3]。然而NZN111能夠以甘露糖、乳糖、果糖和海藻糖等與葡萄糖相同氧原狀態(tài)的糖進行厭氧生長，NZN111的代謝途徑 (見圖 1) 中仍然存在其他一些能夠消耗 NADH產(chǎn)生NAD+的酶，如富馬酸還原酶 (FR)、蘋果酸脫氫酶(MDH) 以及蘋果酸酶 (ME) 等，NZN111本應(yīng)該具有通過三羧酸 (TCA) 循環(huán)還原段來調(diào)節(jié)氧化還原平衡的能力。由此可以看出 NZN111不能代謝葡萄糖的主要原因可能是葡萄糖代謝調(diào)控產(chǎn)生的酶系統(tǒng)中補給途徑和NADH消耗途徑活性不夠?qū)е碌摹?/p>

圖1 大腸桿菌葡萄糖厭氧發(fā)酵途徑Fig. 1 Metabolic pathways in E. coli strain NZN111 under anaerobic condition. Not all the enzyme catalyzed steps and intermediates are shown. PTS: phosphotransferase transport system; PPC: PEP carboxylase; PCK: PEP carboxykinase; PK: pyruvate kinase; PPS: PEP synthetase; PDHc: pyruvate dehydrogenase complex; PTA: phosphoacetyltransferase; ACK: acetate kinase; ICL: isocitrate lyase; MS: malate synthase; MDH: malate dehydrogenase; ME: malic enzyme; FUM: fumarase; SDH: succinate dehydrogenase; and FRD: fumarate reductase. × indicates inactivated reactions. Dashed line indicates the enzyme activity formed in aerobic culture.

葡萄糖對胞內(nèi) cAMP和 cAMP的受體蛋白質(zhì)(Cyclic AMP receptor protein，CRP) 水平具有調(diào)節(jié)作用，分解代謝物敏感操縱子 (Catabolite-sensitive operons) 的轉(zhuǎn)錄受到 CRP和 cAMP結(jié)合產(chǎn)物cAMP-CRP的調(diào)節(jié)，cAMP-CRP與這些基因啟動子上游特定保守序列結(jié)合，激活這些操縱子的轉(zhuǎn)錄[4]，而葡萄糖通過對胞內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶 (Adenylate cyclase，AC) 活性[5]和crp轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控[6]來控制cAMP和CRP的濃度，從而達到對分解代謝敏感操縱子代謝阻遏作用。補給途徑、TCA循環(huán)以及乙醛酸支路的酶如 MDH[7-8]、磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)羧激酶 (PCK)[8-10]、富馬酸酶 (FUM)[11-12]、異檸檬酸裂解酶 (ICL)[8,11]等的表達都受到葡萄糖的分解代謝物阻遏作用，當大腸桿菌在糖異生碳源 (如乙酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸以及延胡索酸等) 或分解代謝物阻遏效應(yīng)較弱的碳源 (如甘油等) 上生長時這些酶的表達受到不同程度的誘導(dǎo)[13-14]。葡萄糖對大腸桿菌中心代謝途徑存在強烈的分解代謝物阻遏作用，直接導(dǎo)致了NZN111在厭氧條件下不能高效代謝葡萄糖，有氧階段以C2-C5等有機酸作為NZN111碳源可以誘導(dǎo)補給途徑、TCA循環(huán)以及乙醛酸支路的酶系，恢復(fù)NZN111在厭氧條件下快速代謝葡萄糖的能力[13-14]。

葡萄糖和糖異生碳源對 NZN111代謝調(diào)節(jié)存在如此巨大差異，其他單糖或雙糖作為有氧碳源對NZN111代謝途徑的調(diào)節(jié)作用是否影響其厭氧代謝葡萄糖的性能？產(chǎn)生的效果是否與葡萄糖類似呢？本研究選用PTS依賴型的單糖果糖以及非PTS依賴的雙糖麥芽糖作為研究對象，發(fā)現(xiàn)以這兩種糖為有氧碳源培養(yǎng)得到的NZN111，在厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖的性能明顯要優(yōu)于葡萄糖，產(chǎn)物分配比例與糖異生碳源培養(yǎng)的菌體差異較大。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

本研究中采用的菌種為LDH和PFL缺失的基因工程大腸桿菌NZN111 [F+λ?rpoS396 (Am) rph-1 ΔpflB::Cam ΔldhA::Kan]，由美國南伊利諾依大學(xué)(Southern Illinois University，US) 的D. P. Clark 教授提供。該菌種?20 ℃保存于25% (W/V) 甘油中。

Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母抽提物5.0，NaCl 10，pH 7.2。

基本鹽 (SM) 培養(yǎng)基 (g/L)：Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43.0，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.011，NH4Cl 1.0，1%維生素B1 0.2 mL/L以及微量元素混合液0.2 mL/L，pH 7.0。微量元素混合液 (g/L)：FeSO4·7H2O 80，MnSO4·nH2O 10，AlCl3·6H2O 10，CoCl24.0，ZnSO4·7H2O 2.0，Na2MoO4·2H2O 2.0，CuCl2·2H2O 1.0，H3BO40.5，溶于3.0 mol/L HCl中。其中維生素B1溶液和微量元素混合液采用微孔濾膜 (0.22 μm) 過濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌冷卻后加入；葡萄糖、硫酸鎂和氯化鈣單獨滅菌后再加入，其他無機鹽混合溶液121 ℃滅菌30 min。

FSM和MSM培養(yǎng)基：SM培養(yǎng)基中分別添加5.0 g/L果糖和麥芽糖。

SMN培養(yǎng)基 (厭氧搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基)：不含氮源的SM培養(yǎng)基，添加15 g/L的葡萄糖和10 g/L的NaHCO3。

5 L發(fā)酵罐使用培養(yǎng)基：添加4.0 g/L的NH4Cl，其他成分與 SM培養(yǎng)基中相同，按不同情況在培養(yǎng)基中分別添加15 g/L果糖和麥芽糖。

抗生素用于種子培養(yǎng)，培養(yǎng)基中卡那霉素的終濃度為30 mg/L，氯霉素的終濃度為34 mg/L。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將1 mL冷凍保存的菌種NZN111接入裝有30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37 ℃，220 r/min的搖床培養(yǎng)9 h。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

整個實驗主要采用的是兩階段培養(yǎng)法，即先有氧培養(yǎng)增殖菌體，然后再轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵[13]。各實驗條件采用2~3個平行實驗。有氧階段，取2 mL活化的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝有100 mL FSM或MSM的500 mL搖瓶中，于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)9 h。培養(yǎng)結(jié)束后，于4 ℃、3 300×g離心10 min，棄去上清液，收集菌體，然后重懸于厭氧SMN培養(yǎng)基中，使菌體密度約為4.0 g DCW/L。50 mL厭氧瓶中加入25 mL菌懸液，通過液面上方空間充以CO2來建立厭氧環(huán)境，于轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度37 ℃的水浴搖床，厭氧培養(yǎng)10 h。

1.2.3 5 L罐培養(yǎng)

5 L玻璃發(fā)酵罐是華東理工大學(xué)原生化工程研究所設(shè)計制造的RIBE-5型，攪拌槳采用本實驗室自行設(shè)計的自吸式攪拌槳，發(fā)酵控制軟件為國家生化工程技術(shù)研究中心 (上海) 的 Tophawk發(fā)酵控制系統(tǒng)，數(shù)據(jù)由計算機采集。

根據(jù)5 L罐初始有氧培養(yǎng)的碳源的不同，轉(zhuǎn)接2 mL一級種子于裝有100 mL FSM或MSM培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，作為5 L罐兩階段培養(yǎng)的二級種子。

發(fā)酵罐裝2.8 L培養(yǎng)基，接入二級種子200 mL，有氧階段培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，初始攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，初始通氣量2.0 L/min，通氣量和攪拌速率根據(jù)溶氧 (DO) 進行手動調(diào)整，以保證整個有氧培養(yǎng)過程中DO在10%以上。NZN111細胞首先在含有15 g/L果糖 (或麥芽糖) 的培養(yǎng)基中生長，當細胞消耗完果糖 (或麥芽糖) 后，直接轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵階段。厭氧狀態(tài)通過在發(fā)酵罐中通入CO2來實現(xiàn)：關(guān)閉空氣入口，從CO2鋼瓶中向發(fā)酵罐液面上方通入CO2，通氣持續(xù)5.0 min，關(guān)閉鋼瓶和發(fā)酵罐排氣口，將發(fā)酵罐上方進氣口與裝有純CO2的橡膠氣袋連接。橡膠袋置于電子秤上，以計量CO2的吸收量。罐液面上方氣體通過自吸式攪拌槳吸入并分散到培養(yǎng)基中并在發(fā)酵罐內(nèi)不斷循環(huán)。厭氧發(fā)酵開始時加入20 g/L葡萄糖，當葡萄糖的濃度降低到5.0 g/L左右時再次加入葡萄糖。pH通過8.0 mol/L的NaOH來控制，有氧階段控制在7.0，厭氧階段控制在6.3。

1.3 分析方法

菌體濃度測定采用濁度法，培養(yǎng)液適當稀釋后，在600 nm測定其光密度 (OD600)，在一定的范圍內(nèi)OD600與菌體干重成線性關(guān)系。

葡萄糖濃度用葡萄糖試劑盒 (上?？菩郎锛夹g(shù)研究所) 測定。

果糖和麥芽糖濃度的測定采用高壓液相色譜法(HPLC)。高壓液相色譜儀是日本島津公司的LC-10AT vp，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H，柱溫65 ℃，檢測器為Knauer RI detector，流動相為5.0 mmol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，進樣20 μL。色譜工作站是杭州英譜科技開發(fā)有限公司開發(fā)的HS2000色譜處理軟件。

發(fā)酵液中乙酸、丙酮酸和琥珀酸濃度用離子色譜法測定。離子色譜儀是Dionex ICS1500，陰離子分析柱為Ionpac AS11-HC (4 mm×250 mm)，保護柱為Ionpac AG11-HC (4 mm×50 mm)，DS6電導(dǎo)檢測器以及陰離子再生抑制器ASRS ULTRAII，梯度儀為Reagent Free Controller-30，Chromeleon Client 6.8色譜工作站。柱溫和檢測器溫度都為30 ℃，流動相為KOH，濃度梯度程序：1.0 mmol/L KOH，8.0 min；在20 min內(nèi)，KOH濃度從1.0 mmol/L勻速增加到30 mmol/L；最后維持30 mmol/L KOH，5.0 min。淋洗液的流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果

2.1 果糖、麥芽糖對NZN111厭氧代謝的影響

搖瓶實驗中，大腸桿菌NZN111在FSM和MSM培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，培養(yǎng)9 h細胞濃度分別為1.31和1.11 g DCW/L，pH在7.3左右，離心分離的菌體重懸于SMN培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵葡萄糖。NaHCO3為琥珀酸發(fā)酵提供CO2來源，同時起著緩沖pH的作用。以果糖和麥芽糖有氧培養(yǎng)的NZN111細胞在厭氧階段葡萄糖的代謝見表1。

以葡萄糖為有氧培養(yǎng)碳源得到的 NZN111在SMN培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)只消耗了3.3 g/L的葡萄糖[13]，而用果糖和麥芽糖培養(yǎng)的NZN111厭氧代謝葡萄糖的性能都有明顯提高，葡萄糖的消耗分別增加了1.82和1.78倍，厭氧代謝終產(chǎn)物主要是琥珀酸和丙酮酸，琥珀酸的濃度分別達到了 5.39和5.03 g/L，琥珀酸和丙酮酸的濃度比分別為1.63∶1和1.45∶1。搖瓶實驗結(jié)果表明，果糖為碳源有氧培養(yǎng)的 NZN111在厭氧發(fā)酵中更傾向于琥珀酸的合成，琥珀酸的得率 (0.88 mol/mol) 比用麥芽糖時(0.84 mol/mol) 略高。對比以葡萄糖為有氧碳源的情況，雖然厭氧條件下葡萄糖代謝和琥珀酸生產(chǎn)得到了提高，但是細胞自溶現(xiàn)象沒有緩解，果糖為有氧碳源培養(yǎng)的細胞10 h后細胞濃度下降了15.2%，麥芽糖為碳源時則達到了 21.3%，而以乙酸為有氧碳源培養(yǎng)得到的細胞基本沒有自溶現(xiàn)象[13]。

2.2 5 L罐中的發(fā)酵

5 L罐中的發(fā)酵同樣采用兩階段發(fā)酵方法，細胞在消耗完15 g/L的果糖或麥芽糖后補加葡萄糖，直接進入?yún)捬醢l(fā)酵過程，發(fā)酵過程曲線見圖 2。有氧階段 NZN111在果糖和麥芽糖為碳源生長時的代謝差異如表2所示。

NZN111以麥芽糖為碳源有氧生長的時間比以果糖為碳源時明顯縮短，但果糖為碳源時幾乎沒有乙酸產(chǎn)生。由表2可以看出，NZN111消耗麥芽糖的時間 (tSE) 為消耗果糖時間的81.4%，最大比生長速率 (μmax) 是果糖的 1.24倍；麥芽糖為碳源時菌體對碳源的得率 (YX/S) 略低，主要原因是有少量的乙酸生成；麥芽糖的比消耗速率 (qs) 比果糖高26.2%。

以果糖或麥芽糖為碳源的有氧培養(yǎng)結(jié)束后，得到的 NZN111菌體不經(jīng)離心分離和濃縮直接轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，厭氧發(fā)酵開始時添加的葡萄糖濃度為20 g/L左右，當葡萄糖濃度降低到5 g/L左右時，第2次添加葡萄糖。第1次加入葡萄糖后，果糖和麥芽糖培養(yǎng)的細胞葡萄糖消耗較快，葡萄糖消耗速率分別達到2.92和2.31 g/(L·h)，主要產(chǎn)物為琥珀酸和丙酮酸，果糖培養(yǎng)的菌體琥珀酸和丙酮酸濃度比為1.63∶1，而麥芽糖培養(yǎng)的菌體則為1∶1，降低了 38.7%，兩種菌體的碳流在丙酮酸節(jié)點上差異較大。這階段果糖培養(yǎng)的細胞琥珀酸生產(chǎn)速率(1.54 g/(L·h)) 高于麥芽糖培養(yǎng)的細胞 (0.98 g/(L·h))，琥珀酸的得率分別為0.81和0.65 mol/mol，丙酮酸的得率分別為0.66和0.86 mol/mol。

表1 搖瓶實驗中有氧階段以果糖和麥芽糖作為碳源對NZN111厭氧代謝葡萄糖和產(chǎn)物形成的影響Table 1 Effects of fructose and maltose as the carbon sources in aerobic culture of E. coli NZN111 on glucose consumption and product formation in subsequent anaerobic fermentation in flasks

表2 在5 L罐兩階段培養(yǎng)過程中NZN111以果糖和麥芽糖為有氧碳源分批培養(yǎng)的代謝特性Table 2 Metabolic performances of NZN111 cultured on fructose and maltose in the aerobic phase of the two-stage cultivation

圖2 NZN111在5 L發(fā)酵罐兩階段發(fā)酵過程菌體生長、葡萄糖消耗、產(chǎn)物生成曲線Fig. 2 Profiles of cell growth, glucose consumption, metabolites accumulation in two-stage cultivation of NZN111 in a 5 L bioreactor. (A) Fructose as the aerobic carbon source. (B) Maltose as the aerobic carbon source. △ fructose; ▲ maltose; cell density;■ glucose; ● succinic acid; ＊pyruvic acid; ○ acetic acid; + ethanol.

在第2次加入葡萄糖后，葡萄糖消耗速率和琥珀酸的生產(chǎn)速率明顯降低。果糖培養(yǎng)的細胞基本耗完了加入的葡萄糖 (殘留僅為1.21 g/L)，而麥芽糖培養(yǎng)的細胞在厭氧發(fā)酵終了時殘?zhí)菨舛冗€有10.2 g/L。麥芽糖培養(yǎng)的細胞琥珀酸和丙酮酸濃度比有所增加，達到了 1.38，整個厭氧發(fā)酵最終的比值為 1.21；果糖培養(yǎng)得到的菌體厭氧產(chǎn)物的比值增加的幅度不大 (1.76)，整體較為穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時的比值為 1.73。以果糖和麥芽糖為碳源有氧培養(yǎng)的細胞厭氧發(fā)酵階段分別維持了33.2和38.0 h，最終琥珀酸得率分別為0.84和0.75 mol/mol，丙酮酸得率分別達到了0.65和0.83 mol/mol，琥珀酸最終濃度分別為18.0和15.7 g/L，丙酮酸最終濃度分別達到了10.5和13 g/L。

兩種情況的厭氧發(fā)酵階段都存在細胞自溶現(xiàn)象，第一次加糖階段尤為明顯，果糖培養(yǎng)的菌體下降了13.1%，麥芽糖得到的菌體下降了16.1%，這一趨勢與搖瓶實驗相同，發(fā)酵終了時兩者細胞濃度下降相差不大 (33%左右)。

3 討論

自然界中存在多種糖類化合物，Monod把這些糖分為兩類：A類包括甘露糖、甘露醇和果糖，它們與葡萄糖同時存在于培養(yǎng)基中時，細菌不會出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象，它們主要通過與葡萄糖類似的 PTS系統(tǒng)進入細胞；B類包括阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、木糖和半乳糖等，它們和葡萄糖同時加入培養(yǎng)基中后，細菌則表現(xiàn)出二次生長現(xiàn)象，它們通過非 PTS的透性酶系統(tǒng)進入細胞[15-16]。果糖通過果糖相關(guān)的PTS系統(tǒng)進入細胞，果糖操縱子 (fruBKA基因) 受到果糖阻遏蛋白 (Fructose repressor，F(xiàn)ruR，也稱為Cra) 的阻遏，中間代謝產(chǎn)物1-磷酸果糖和1,6-二磷酸果糖是FruR的效應(yīng)子，它們與FruR結(jié)合后使其失活[17-18]，減少了FruR的阻遏作用，誘導(dǎo)果糖操縱子的表達。麥芽糖是 2個葡萄糖分子以 α-1,4 糖苷鍵連接起來的雙糖，屬于非PTS系統(tǒng)的糖類，它進入大腸桿菌細胞內(nèi)是通過周質(zhì)麥芽糖結(jié)合蛋白(MalE) 和需ATP提供能量的多亞基ABC運輸系統(tǒng)(MalFGK2)，這些蛋白的表達受到 MalT蛋白正調(diào)控[19]。在轉(zhuǎn)錄層面，MalT的轉(zhuǎn)錄受到 PTS系統(tǒng)的調(diào)控，Mlc阻遏MalT的轉(zhuǎn)錄，去磷酸化的Enzyme IICBGlu與 Mlc結(jié)合使得 Mlc的阻遏性能喪失，而cAMP-CRP結(jié)合體則對MalT的轉(zhuǎn)錄具有激活作用，這兩個葡萄糖相關(guān)的調(diào)控機制存在矛盾性，具體相互協(xié)調(diào)的作用機理至今尚不確切。在蛋白活性層面，麥芽糖和ATP對MalT蛋白具有激活作用[20]。我們考察果糖和麥芽糖作為有氧碳源對 NZN111厭氧代謝葡萄糖生產(chǎn)琥珀酸的影響，發(fā)現(xiàn)果糖和麥芽糖代謝調(diào)控效果雖然不如糖異生碳源，但可以較好恢復(fù)NZN111厭氧代謝葡萄糖性能，主要代謝產(chǎn)物是琥珀酸和丙酮酸。

大腸桿菌通過多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控胞內(nèi)各種分解代謝和合成代謝途徑來適應(yīng)不同碳源上的生長?；谀壳皩Ψ纸獯x調(diào)控研究的成果，分解代謝調(diào)控主要分為兩類：cAMP依賴型 (cAMP-CRP) 和cAMP非依賴型 (FruR)，見圖 3。Perrenoud 等[22]對fruR、crp和cya敲除進行了研究，發(fā)現(xiàn)缺失fruR對細胞在葡萄糖上生長沒有影響，而crp和cya的敲除則大大降低了葡萄糖的利用速度，減緩了細胞的生長。cAMP依賴的分解代謝阻遏調(diào)控作用對細胞代謝的影響要遠大于fruR的調(diào)控作用。從cAMP依賴的分解代謝阻遏模型來看，培養(yǎng)基中不存在葡萄糖時，胞內(nèi)磷酸化的Enzyme IIAGlu濃度較高，腺苷環(huán)化酶被激活，胞內(nèi)cAMP水平增加，cAMP與受體蛋白CRP結(jié)合后高效結(jié)合到DNA上激活胞內(nèi)超過100個啟動子的轉(zhuǎn)錄[23]，其中包括糖異生途徑基因 (pck)、乙醛酸支路基因 (aceAB) 和TCA途徑基因 (mdh、sdhABCD、fumA、gltA和 acnAB等)[22,24]。Nam 等[25]測定了以果糖和麥芽糖為碳源時胞內(nèi)磷酸化的Enzyme IIAGlu和cAMP的濃度，兩者濃度明顯高于以葡萄糖為碳源的情況，此時糖異生途徑、乙醛酸支路以及TCA途徑基因轉(zhuǎn)錄被激活。同樣，Bettenbrock等[26]對在不同碳源上生長的大腸桿菌胞內(nèi)磷酸化的Enzyme IIAGlu和cAMP的濃度以及PEP和丙酮酸的比值進行測定，發(fā)現(xiàn)糖異生碳源(包括乙酸、琥珀酸)、果糖、麥芽糖以及甘油為碳源培養(yǎng)得到的細胞，三者明顯高于葡萄糖培養(yǎng)的細胞。細胞內(nèi)部這些信號物質(zhì)的積累有利于cAMP-CRP的形成，引起糖異生途徑基因 (pck)、乙醛酸支路基因(aceAB) 和TCA途徑基因 (mdh、sdhABCD、fumA、gltA和acnAB等) 轉(zhuǎn)錄的激活。代謝調(diào)控非常復(fù)雜，不同的調(diào)控子之間還有影響，在 fur (Ferric uptake regulator) 缺失的大腸桿菌菌株中乙醛酸支路受 crp負調(diào)控[27]。

圖3 大腸桿菌依賴和非依賴cAMP的分解代謝調(diào)控[20]Fig. 3 The cAMP-dependent or independent catabolic regulation of the central carbon metabolism in Escherichia coli[20]. Filled green ellipses represent transcriptional regulators assigned to catabolite control. Non-filled ellipses correspond to proteins (and ribosome) involved in signal transduction. Red coloured ellipses represent intracellular signalling molecules. Shortdashed lines: transcriptional regulation; long dashed lines: regulation of enzyme activity. +: positive regulation; ?: negative regulation; +/?: positive and negative regulation.

FruR (Cra) 為不依賴cAMP的分解代謝阻遏和激活全局調(diào)控因子，通過對中心代謝途徑中碳代謝和能量代謝相關(guān)酶基因表達的調(diào)控來調(diào)節(jié)中心代謝途徑的碳流[17,28]。FruR 對糖酵解途徑的基因 (如pfkA、pykA、gapA、pgk以及eno等)、ED途徑基因(如 edd和 eda) 以及非葡萄糖的代謝基因 (如果糖操縱子 fruBKA、甘露醇操縱子 mtlADR) 有阻遏作用，但對糖異生途徑基因 (fbp、pckA和 ppsA)、乙醛酸支路基因 (aceBA) 以及 TCA途徑基因有激活作用。FruR缺失的菌株不能在以乙酸、丙酮酸或TCA中間代謝產(chǎn)物為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中生長[29]，主要原因是大腸桿菌在糖異生碳源上的生長受到pps和pck的控制[30]，ppsA上游區(qū)域只有FruR結(jié)合位點，不存在其他調(diào)節(jié)子結(jié)合位點，糖異生關(guān)鍵酶 PPS的表達對 FruR有較大的依賴性[18]。大腸桿菌中過量表達不包括 fruR的果糖操縱子(fruBKA) 對糖異生途徑、TCA循環(huán)以及乙醛酸途徑酶的表達也有類似的阻遏作用[31]，過量表達果糖操縱子為 1-磷酸果糖和 1,6-二磷酸果糖的合成提供了大量的酶源，生成的 1-磷酸果糖和 1,6-二磷酸果糖抑制了FruR的活性。果糖經(jīng)過PTS系統(tǒng)進入細胞，被Enzyme IIAfru磷酸化生成1-磷酸果糖，1-磷酸果糖由 1-磷酸果糖激酶磷酸化生成 1,6-二磷酸果糖，1-磷酸果糖和1,6-二磷酸果糖與部分FruR結(jié)合抑制了它們的活性，減小了FruR對糖異生途徑基因、乙醛酸支路基因以及TCA途徑基因的激活作用。

綜上所述，結(jié)合 NZN111厭氧代謝的結(jié)果來看，果糖和麥芽糖對糖異生途徑基因、乙醛酸支路基因以及 TCA途徑基因的調(diào)控效果優(yōu)于以葡萄糖為有氧碳源的代謝調(diào)控，更有利于NZN111厭氧條件下胞內(nèi)的氧化還原平衡，改善了其厭氧條件下的葡萄糖代謝能力。

REFERENCES

[1] Bunch PK, Mat-Jan F, Lee N, et al. The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Microbiology, 1997, 143: 187?195.

[2] Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(4): 1715?1727.

[3] Singh A, Lynch MD, Gill RT. Genes restoring redox balance in fermentation-deficient E. coli NZN111. Metab Eng, 2009, 11(6): 347?354.

[4] Kolb A, Busby S, Buc H, et al. Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annu Rev Biochem, 1993, 62: 749?795.

[5] Saier MH Jr, Feucht BU. Coordinate regulation of adenylate cyclase and carbohydrate permeases by the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system in Salmonella typhimurium. J Biol Chem, 1975, 250(17): 7078?7080.

[6] Ishizuka H, Hanamura A, Inada T, et al. Mechanism of the down-regulation of cAMP receptor protein by glucose in Escherichia coli: role of autoregulation of the crp gene. EMBO J, 1994, 13(13): 3077?3082.

[7] Park SJ, Cotter PA, Gunsalus RP. Regulation of malate dehydrogenase (mdh) gene expression in Escherichia coli in response to oxygen, carbon, and heme availability. J Bacteriol, 1995, 177(22): 6652?6656.

[8] Goldie AH, Sanwal BD. Genetic and physiological characterization of Escherichia coli mutants deficient in phosphoenolpyruvate carboxykinase activity. J Bacteriol, 1980, 141(3): 1115?1121.

[9] Goldie AH. Regulation of transcription of the Escherichia coli phosphoenolpyruvate carboxykinase locus: studies with pck-lacZ operon fusions. J Bacteriol, 1984, 159(3): 832?836.

[10] Cronan JE Jr, LaPorte D. Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass//Neidhardt FC, Curtiss R, Ingraham HL, et al. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. 2nd ed. Washington DC: ASM Press, 1999: 343?357.

[11] Peng L, Shimizu K. Global metabolic regulation analysis for Escherichia coli K12 based on protein expression by 2-dimensional electrophoresis and enzyme activity measurement. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 61(2): 163?178.

[12] Park SJ, Gunsalus RP. Oxygen, iron, carbon, and superoxide control of the fumarase fumA and fumC genes of Escherichia coli: role of the arcA, fnr, and soxR gene products. J Bacteriol, 1995, 177(21): 6255?6262.

[13] Wu H, Li ZM, Zhou L, et al. Improved succinic acid production in the anaerobic culture of an Escherichia coli pflB ldhA double mutant as a result of enhanced anaplerotic activities in the preceding aerobic culture. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(24): 7837?7843.

[14] Wu H, Li ZM, Zhou L, et al. Enhanced anaerobic succinic acid production by Escherichia coli NZN111 aerobically grown on gluconeogenic carbon sources. Enzyme Microb Tech, 2009, 44(3): 165?169.

[15] Deutscher J, Francke C, Postma PW. How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev, 2006, 70(4): 939?1031.

[16] Ullmann A. Catabolite repression: a story without end. Res Microbiol, 1996, 147(6/7): 455?458.

[17] Ramseier TW, Bledig S, Michotey V, et al. The global regulatory protein FruR modulates the direction of carbon flow in Escherichia coli. Mol Microbiol, 1995, 16(6): 1157?1169.

[18] Saier MH Jr, Ramseier TM. The catabolite repressor/ activator (Cra) protein of enteric bacteria. J Bacteriol, 1996, 178(12): 3411?3417.

[19] Dippel R, Boos W. The maltodextrin system of Escherichia coli: metabolism and transport. J Bacteriol, 2005, 187(24): 8322?8331.

[20] Schlegel A, B?hm A, Lee SJ, et al. Network regulation of the Escherichia coli maltose system. J Mol Microbiol Biotechnol, 2002, 4(3): 301?307.

[21] Hardiman T, Lemuth K, Keller MA, et al. Topology of the global regulatory network of carbon limitation in Escherichia coli. J Biotechnol, 2007, 132(4): 359?374.

[22] Perrenoud A, Sauer U. Impact of global transcriptional regulation by ArcA, ArcB, Cra, Crp, Cya, Fnr, and Mlc on glucose catabolism in Escherichia coli. J Bacteriol, 2005, 187(9): 3171?3179.

[23] Brückner R, Titgemeyer F. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization. FEMS Microbiol Lett, 2002, 209(2): 141?148.

[24] Nanchen A, Schicker A, Revelles O, et al. Cyclic AMP-dependent catabolite repression is the dominant control mechanism of metabolic fluxes under glucose limitation in Escherichia coli. J Bacteriol, 2008, 190(7): 2323?2330.

[25] Nam TW, Park YH, Jeong HJ, et al. Glucose repression of the Escherichia coli sdhCDAB operon, revisited: regulation by the CRP·cAMP complex. Nucleic Acids Res, 2005, 33(21): 6712?6722.

[26] Bettenbrock K, Sauter T, Jahreis K, et al. Correlation between growth rates, EIIACrrphosphorylation, and intracellular cyclic AMP levels in Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 2007, 189(19): 6891?6900.

[27] Zhang ZG, Gosset G, Barabote R, et al. Functional interactions between the carbon and iron utilization regulators, Crp and Fur, in Escherichia coli. J Bacteriol, 2005, 187(3): 980?990.

[28] Ramseier TM. Cra and the control of carbon flux via metabolic pathways. Res Microbiol, 1996, 147(6/7): 489?493.

[29] Chin AM, Feucht BU, Saier MH Jr. Evidence for regulation of gluconeogenesis by the fructose phosphotransferase system in Salmonella typhimurium. J Bacteriol, 1987, 169(2): 897?899.

[30] Chao YP, Patnaik R, Roof WD, et al. Control of gluconeogenic growth by pps and pck in Escherichia coli. J Bacteriol, 1993, 175(21): 6939?6944.

[31] Chin AM, Feldheim DA, Saier MH Jr. Altered transcriptional patterns affecting several metabolic pathways in strains of Salmonella typhimurium which overexpress the fructose regulon. J Bacteriol, 1989, 171(5): 2424?2434.