利用乙醇發(fā)酵副產(chǎn)CO2培養(yǎng)富含淀粉亞心型四爿藻作為其補(bǔ)充原料

廖莎，姚長洪，薛松，張衛(wèi)，白鳳武

1 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，大連 116024

2 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 海洋生物產(chǎn)品工程組，大連 116023

3 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

4 Flinders Centre for Marine Bioprocessing and Bioproducts, Flinders University, Bedford Park, Adelaide, SA5042, Australia

基于可再生生物質(zhì)資源生產(chǎn)生物燃料是解決當(dāng)前石油資源短缺，石油基燃料及產(chǎn)品大量消費導(dǎo)致溫室氣體總量不斷增加等諸多問題的有效途徑之一。

與高等植物相比，微藻具有光和效率高、單位面積生物量產(chǎn)量大的突出特點，已經(jīng)成為國內(nèi)外生物能源基礎(chǔ)研究和技術(shù)開發(fā)的熱點，但目前的研究工作主要集中在產(chǎn)油微藻生產(chǎn)生物柴油[1]，對富含淀粉可用于燃料乙醇生產(chǎn)的微藻卻很少關(guān)注。

能源微藻應(yīng)該采用戶外開放模式直接利用太陽光低成本培養(yǎng)[2]，但這種培養(yǎng)模式不可避免面臨兩大突出問題：一是CO2無法向密閉的光反應(yīng)器培養(yǎng)那樣可以通過循環(huán)使用來提高其利用效率，因此CO2作為原料消耗的成本將十分可觀；二是培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度很低，從大量培養(yǎng)液中分離回收微藻的能耗成本會很高。

乙醇發(fā)酵副產(chǎn)與乙醇產(chǎn)量基本相當(dāng)?shù)?CO2，目前由于沒有經(jīng)濟(jì)可行的利用渠道而直接排放。這種發(fā)酵產(chǎn)生的 CO2，與熱電和冶金等行業(yè)產(chǎn)生的煙道氣相比，不僅純度高，不含有害雜質(zhì)，而且溫度適宜 (煙道氣余熱回收后的溫度仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于微藻培養(yǎng)溫度，由于氣體傳熱效率很低，因此需要換熱面積龐大的換熱設(shè)備將低溫?zé)煹罋饫鋮s降溫)，更適宜于微藻培養(yǎng)。如果用來培養(yǎng)富含淀粉的微藻，利用乙醇發(fā)酵系統(tǒng)自身產(chǎn)生的不超過0.05 MPa的微壓力直接輸送到微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，微藻培養(yǎng)的CO2原料成本可以顯著降低，而收集的微藻生物質(zhì)可以直接用來作為淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)的補(bǔ)充原料。

綠藻是一類積累淀粉作為自身能源的藻類，包括小球藻Chlorella vulgaris[3]、斜柵藻Scenedesmus basilensis[4]和萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii[5]等。本實驗室篩選得的亞心形四爿藻 Tetraselmis subcordiformis為一株海洋綠藻。與淡水藻相比，海水藻培養(yǎng)可以減少對淡水資源的需求，在淡水資源緊張的今天，有較好的應(yīng)用前景。初步研究工作表明，此藻有較好的淀粉積累能力。

本文首先研究了T. subcordiformis的培養(yǎng)，進(jìn)而對乙醇發(fā)酵與 T. subcordiformis培養(yǎng)耦合的可行性進(jìn)行了分析，在此基礎(chǔ)上建立了乙醇發(fā)酵偶聯(lián)微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，探討了這類微藻生物質(zhì)作為淀粉質(zhì)原料乙醇發(fā)酵補(bǔ)充原料的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和藻種

Saccharomyces cerevisiae用于乙醇發(fā)酵，由大連理工大學(xué)生物工程系保藏。

T. subcordiformis為一種海洋單細(xì)胞浮游藻類，屬綠藻門 Chlorophyta，綠藻綱 Chlorophyeeae，團(tuán)藻目Volvocales，衣藻科Chlamydomonaeeae，四爿藻屬 Tetraselmis，適應(yīng)性強(qiáng)，生長繁殖迅速，通過光合作用可在胞內(nèi)積累淀粉，由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程組保藏[6]。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母斜面培養(yǎng)基 (g/L)[7]：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨5，瓊脂 15，滅菌后冷卻到室溫，接種后恒溫30 ℃培養(yǎng)至菌落飽滿，作為斜面種子，4 ℃保藏。

酵母種子培養(yǎng)基 (g/L)[7]：葡萄糖 10，酵母粉20，蛋白胨20，121 ℃滅菌15 min，冷卻后使用。

酵母擴(kuò)大培養(yǎng)及乙醇連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)[7]：葡萄糖150，酵母粉5，蛋白胨5，121 ℃滅菌15 min，冷卻后使用。

T. subcordiformis種子培養(yǎng)基[8]：優(yōu)化的海水康維方培養(yǎng)基。

10 L規(guī)模反應(yīng)器T. subcordiformis培養(yǎng)用培養(yǎng)基[9]：海水8 L，康維方營養(yǎng)鹽溶液10 mL (表1)。

表1 康維方營養(yǎng)鹽溶液配方Table 1 Nutrient composition of Kang Weifang solution

1.2 T. subcordiformis的培養(yǎng)

T. subcordiformis培養(yǎng)方法由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程組提供。實驗用海水取自大連黑石礁海域，海水經(jīng)砂濾，110 ℃滅菌15 min后，自平板接一環(huán)藻種于100 mL培養(yǎng)基中，在溫度 (25±1) ℃，光照強(qiáng)度50 μmol E/(m2·s)，光暗比14∶10條件下，培養(yǎng)至對數(shù)生長期[8]。在相同培養(yǎng)條件下擴(kuò)大到500 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再擴(kuò)培到2 L培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6~7 d，可作為光反應(yīng)器培養(yǎng)的藻種。

10 L有機(jī)玻璃平板光照反應(yīng)器經(jīng) 0.44‰的NaClO溶液滅菌12 h后，加入8 L滅菌后的海水，然后添加10 mL康維方營養(yǎng)鹽溶液，隨后接入2 L藻種，使總工作容積達(dá)到10 L，培養(yǎng)溫度 (28±2) ℃，光照強(qiáng)度140 μmol E/(m2·s)，通氣量0.125 vvm。研究結(jié)果表明，通氣中CO2濃度對微藻細(xì)胞生長和胞內(nèi)淀粉積累有重要影響，通入 3%的CO2時胞內(nèi)淀粉含量較高。因此，將 CO2濃度調(diào)節(jié)為 3%，分別來自瓶裝商品CO2和乙醇發(fā)酵副產(chǎn)的CO2[10]。反應(yīng)器連續(xù)光照培養(yǎng)至第7天收獲。

1.3 乙醇發(fā)酵與微藻培養(yǎng)的偶聯(lián)

1.3.1 酵母搖瓶種子培養(yǎng)

自斜面接一環(huán)菌種于盛裝 150 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于搖床中在150 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)20~22 h[7]。

1.3.2 1.5 L發(fā)酵罐酵母擴(kuò)大培養(yǎng)

以10%的接種量將搖瓶培養(yǎng)的酵母種子接入含有1 L擴(kuò)大培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進(jìn)行間歇擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵罐攪拌速率150 r/min，培養(yǎng)溫度30 ℃，pH控制為4.5，通氣量100 mL/min，相當(dāng)于單位體積通氣量為0.067 vvm，既保持乙醇發(fā)酵要求的厭氧環(huán)境，又提供微量氧促進(jìn)酵母細(xì)胞生長。待葡萄糖濃度下降至1 g/L時切換為連續(xù)發(fā)酵，控制流加稀釋率為0.065 h?1，達(dá)到恒化狀態(tài)后，流出發(fā)酵罐的發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛瓤梢跃S持在1 g/L以下。

1.3.3 乙醇發(fā)酵與微藻培養(yǎng)的偶聯(lián)

乙醇發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定后，將富含CO2的尾氣按照需要的流量通入10 L規(guī)模平板光照反應(yīng)器中培養(yǎng)微藻 (培養(yǎng)方法同1.2)，至兩個系統(tǒng)均穩(wěn)定運行。

1.4 利用富含淀粉微藻生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇

1.4.1 微藻生物質(zhì)預(yù)處理

收獲后的亞心形四爿藻5.0 g加入100 mL去離子水，600 W超聲處理[11]后調(diào)解pH到6.0~6.5，加入10 μL液化酶 (Liquozyme supra NBSSG4163)，加熱到80~90 ℃，保溫液化1~1.5 h后，冷卻到60 ℃~ 65 ℃，調(diào)節(jié) pH到 4.0~4.5，加入 20 μL糖化酶(Dextrozyme dx NCSP0041)，保溫糖化10~12 h[12]，離心取上清液供發(fā)酵使用，設(shè)置2個平行樣。

1.4.2 乙醇發(fā)酵

同1.2.1的方法培養(yǎng)酵母，經(jīng)1.3.2預(yù)處理后的培養(yǎng)基中均加入1 g酵母粉和2 g蛋白胨，121 ℃滅菌15 min，冷卻后以10%的接種量接入已培養(yǎng)好的酵母，置于30 ℃、150 r/min的搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣。

1.5 檢測方法

1.5.1 細(xì)胞干重

微藻細(xì)胞干重：取4 mL藻液2 000 r/min離心2 min，用0.5 mol/L的NH4HCO3溶液洗滌2次，置于80 ℃烘箱烘至恒重，取2個測量誤差在±10%平行樣的平均值。

酵母細(xì)胞干重：取4 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心3 min，用去離子水洗滌2次，置于80 ℃烘箱烘至恒重，取2個平行樣，測量誤差控制在±10%，取平均值。

1.5.2 淀粉含量測定

取20 mL微藻培養(yǎng)液離心后，少量去離子水洗2次，加入20 mL去離子水，冰水浴600 W超聲處理后，經(jīng)液化酶和糖化酶處理后定容到 50 mL，用SBA-40C生物傳感器 (山東省科學(xué)院) 檢測葡萄糖含量。淀粉含量 (g/g)=葡萄糖 (g/L)×0.05 (L)×0.9/細(xì)胞干重 (g)。

1.5.3 藻細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)的測量

用 Water-PAM 葉綠素?zé)晒鈨x (Walz, Germany)測定光合系統(tǒng)Ⅱ (Photosystem Ⅱ，簡稱 PS Ⅱ) 實際光化學(xué)量子產(chǎn)量ΔF/Fm’。取3 mL過濾后的海水，根據(jù)培養(yǎng)過程藻細(xì)胞濃度，加入適量藻液 (2~10 μL)于測量杯中，混勻，打開光化光 (Actinic light)，使葉綠素?zé)晒庵翟?00~500單位左右，再用強(qiáng)飽和脈沖光 (150 μ mol E/(m2·s)) 激發(fā)0.6 s，測量ΔF/Fm’[13]。

1.5.4 葡萄糖和乙醇的檢測

利用SBA-40C生物傳感器 (山東省科學(xué)院) 直接檢測葡萄糖和乙醇。乙醇得率 (%)=實際產(chǎn)生的乙醇量 (g)/理論應(yīng)產(chǎn)生的乙醇量 (g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇發(fā)酵偶聯(lián)微藻培養(yǎng)的可行性分析

乙醇發(fā)酵與富含淀粉的微藻培養(yǎng)偶聯(lián)，既避免了乙醇生產(chǎn)過程向環(huán)境大量排放 CO2，同時又節(jié)省了微藻培養(yǎng)所需CO2的原料成本，收獲的微藻生物質(zhì)還可以作為燃料乙醇生產(chǎn)的補(bǔ)充原料。在這一思想指導(dǎo)下，我們在實驗室建立了圖1所示的耦合系統(tǒng)。文獻(xiàn)報道亞心形四爿藻的最高含碳量為38%[6]，初步實驗數(shù)據(jù)表明該藻每天最多可積累0.5 g/L生物質(zhì)，據(jù)此可以推算出每天單位體積 (L) 光反應(yīng)器微藻培養(yǎng)最多可以吸收CO2約0.697 g。本研究使用的2.5 L發(fā)酵罐，工作容積1.5 L，以0.065 h?1的稀釋速率流加葡萄糖濃度150 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，恒化條件下發(fā)酵液中乙醇濃度平均為70 g/L，每天產(chǎn)生CO2約為156.7 g，因此該發(fā)酵系統(tǒng)理論上可與225 L的微藻培養(yǎng)反應(yīng)器偶聯(lián)。

為了便于實驗操作，我們基于現(xiàn)有10 L規(guī)模微藻培養(yǎng)反應(yīng)器，在使用瓶裝商品 CO2為碳源培養(yǎng)微藻使其胞內(nèi)富集淀粉基礎(chǔ)上，將乙醇發(fā)酵生產(chǎn) CO2直接通入微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，控制尾氣流量為72 mL/min，使進(jìn)入光反應(yīng)器的氣體CO2含量保持在3%左右，研究2個系統(tǒng)耦合的可行性。

圖1 乙醇連續(xù)發(fā)酵耦聯(lián)微藻培養(yǎng)生產(chǎn)富含淀粉微藻生物質(zhì)作為乙醇生產(chǎn)補(bǔ)充原料Fig. 1 Continuous ethanol fermentation coupled with microalgae culture for algae-based starch as an alternative feedstock for ethanol production.

2.2 微藻培養(yǎng)及淀粉積累

以瓶裝商品CO2為碳源，10 L平板光反應(yīng)器中培養(yǎng)T. subcordiformis細(xì)胞生長狀況如圖2a所示，可見接種后的前2 d由于藻細(xì)胞從搖瓶接入反應(yīng)器后需要一定時間適應(yīng)新的環(huán)境，所以生長緩慢，處于延滯期；第2天開始進(jìn)入指數(shù)生長期。微藻培養(yǎng)的前3 d，環(huán)境中的營養(yǎng)元素豐富，光合作用效率高，微藻固定CO2進(jìn)行細(xì)胞生長，淀粉積累迅速，淀粉占干細(xì)胞的比例從初始的不到 2%上升到第 3天的20%。

PS II實際光化學(xué)量子產(chǎn)率ΔF/Fm’反映藻細(xì)胞開放的PS II反應(yīng)中心原初光能捕獲效率，其值越高表明葉綠體捕獲用于光合作用的光量子越多，光能利用效率越高[14]。當(dāng)藻細(xì)胞生長受到環(huán)境因子及營養(yǎng)條件等脅迫時，實際光化學(xué)量子產(chǎn)率就會明顯下降。從圖2a可以看出，從第3天開始ΔF/Fm’值開始下降，表明此時微藻細(xì)胞已經(jīng)處于營養(yǎng)限制狀態(tài)，但仍然積累大量淀粉[15]；第4天后藻細(xì)胞可能由于光合作用效率降低，無法滿足細(xì)胞生長的能量需求而動用自身積累的能量物質(zhì)如淀粉供其繼續(xù)生長，所以淀粉含量略有下降的趨勢。到培養(yǎng)第 7天雖然淀粉含量下降為 (45.60±1.72)%，但生物量達(dá)到最大值(1.85±0.04) g/L，此時單位反應(yīng)器體積的淀粉產(chǎn)量較高，達(dá)到 (0.84±0.03) g/L。綜合考慮生物質(zhì)和淀粉含量的變化，在第7天收獲藻細(xì)胞較合適。

利用乙醇發(fā)酵副產(chǎn) CO2為碳源培養(yǎng)微藻的實驗結(jié)果如圖2b所示，可見其他培養(yǎng)條件相同條件下，獲得的微藻生物量濃度和胞內(nèi)淀粉積累差別不大，表明利用這種廉價的 CO2替代價格相對昂貴的瓶裝商品CO2培養(yǎng)微藻，使其胞內(nèi)積累淀粉是可行的。

2.3 利用微藻生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇

T. subcordiformis經(jīng)光照培養(yǎng)后，胞內(nèi)積累淀粉，需要對藻細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)處理，將淀粉釋放出來，再將其轉(zhuǎn)化成酵母可利用的糖。文獻(xiàn)報道的微藻預(yù)處理方法很多，如酸解法[4]、超聲法[16]、凍融法[17]、暗誘導(dǎo)法[18]、微波法[19]等，結(jié)合目前淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)的實際情況，我們對微藻生物質(zhì)采用超聲預(yù)處理后酶解的方法制備可發(fā)酵性糖。

T. subcordiformis藻粉通過1.3.2的方法處理后，檢測水解液中葡萄糖的含量為18.0 g/L；藻粉的淀粉含量為45.6%，在料液比1∶20的情況下，5 g藻粉中的淀粉完全水解生成葡萄糖的理論值為25.3 g/L，因此該方法葡萄糖的釋放量為71.1%。

圖2 商品CO2(a) 和乙醇發(fā)酵副產(chǎn)CO2(b) 為碳源條件下的微藻生長 (A)，PSⅡ光化學(xué)量子產(chǎn)率ΔF/Fm’(B) 及淀粉積累 (C)Fig. 2 Microalgal growth (A), photochemical efficiency of PSⅡ (ΔF/Fm’) (B) and starch accumulation (C) with CO2 commercially available (a) and produced by ethanol fermentation (b) as carbon source.

圖3所示為乙醇發(fā)酵的實驗結(jié)果。酵母發(fā)酵6 h到達(dá)終點，生物量由0.825 g/L增加到4.43 g/L，乙醇濃度由接種初始的1.07 g/L增加到9.13 g/L，乙醇對總糖的得率系數(shù)為 0.447，為理論值 0.511的87.6%。

圖3 S. cerevisiae發(fā)酵T. subcordiformis生物質(zhì)微波預(yù)處理后的酶解液生產(chǎn)乙醇Fig. 3 Ethanol production with S. cerevisiae using the enzymatic hydrolysate of T. subcordiformis biomass pretreated by ultrasonic radiation. A: glucose; B: ethanol; C: biomass.

玉米原料的淀粉含量一般在60%~70%，目前培養(yǎng)的微藻生物質(zhì)淀粉含量在45%~50%，進(jìn)一步通過代謝調(diào)控等策略提高微藻生物質(zhì)淀粉含量，作為淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)補(bǔ)充原料是可行的，可以減少燃料乙醇生產(chǎn)對糧食的消耗。

3 結(jié)論

以乙醇發(fā)酵副產(chǎn) CO2為碳源培養(yǎng) T. subcordiformis富集淀粉是可行的，10 L平板光照反應(yīng)器培養(yǎng)7 d后，藻細(xì)胞干重達(dá)到2.0 g/L左右，胞內(nèi)淀粉積累達(dá)到 45%~46%。分析并建立了乙醇發(fā)酵偶聯(lián)微藻培養(yǎng)系統(tǒng)，表明其技術(shù)上可行，為乙醇發(fā)酵副產(chǎn)CO2的利用開辟了一個新的途徑。藻粉經(jīng)過超聲及酶處理后，葡萄糖釋放量為淀粉總量的71.1%左右，S. cerevisiae利用其水解液發(fā)酵乙醇得率達(dá)到理論值的 87.6%。因此，利用乙醇發(fā)酵副產(chǎn)CO2偶聯(lián)微藻培養(yǎng)生產(chǎn)富含淀粉的微藻生物質(zhì)，可以作為淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)的補(bǔ)充原料，后續(xù)工作應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化藻細(xì)胞代謝途徑和培養(yǎng)工藝條件，提高胞內(nèi)淀粉含量和培養(yǎng)過程細(xì)胞密度，最大限度地降低微藻生物質(zhì)生產(chǎn)成本，同時開發(fā)適宜的預(yù)處理方式提高藻細(xì)胞內(nèi)淀粉的釋放效率。

REFERENCES

[1] Waltz E. Biotech’s green gold? Nat Biotechnol, 2009, 27(1): 15?18.

[2] Huang YM, Wang LW, Li YG, et al. Strategies for research and development and commercial production of microalgae bioenergy. Chin J Biotech, 2010, 26(7): 907?913.黃英明, 王偉良, 李元廣, 等. 微藻能源技術(shù)開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展思路與策略. 生物工程學(xué)報, 2010, 26(7): 907?913.

[3] Doucha J, Lívansky K. Outdoor open thin-layer microalgal photobioreactor: potential productivity. J Appl Phycol, 2009, 21(1): 111?117.

[4] Tatsumi C, Ogaki M, Tanabe. Method of producing ethanol: UK, GB 149380 (A). 1975-12-15.

[5] Nguyen MT, Choi SP, Lee JW, et al. Hydrothermal acid pretreatment of Chlamydomonas reinhardtii biomass for ethanol production. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(2): 161?166.

[6] Guo Z. High-density cell cultivation for photobiological hydrogen production by marine green alga Platymonas subcordiformis [D]. Dalian: Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, 2008.郭禎. 扁藻高密度培養(yǎng)調(diào)控產(chǎn)氫工藝的研究[D]. 大連:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 2008.

[7] Li F, Ge XM, Li N, et al. Consecutive very-high-gravity batch ethanol fermentation with self-flocculation yeast, Chin J Biotech, 25(9): 1329?1337.李凡, 葛旭萌, 李寧, 等. 自絮凝酵母高濃度重復(fù)批次乙醇發(fā)酵. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(9): 1329?1337.

[8] Liu Y, Chen ZA, Lu HB, et al. Optimization of culture medium and photosynthetic characteristics of Platymonas subcordiformis. Chin J Pro Eng, 2007, 7(6): 1197?1201.劉遠(yuǎn), 陳兆安, 陸洪斌, 等. 亞心形扁藻培養(yǎng)基的優(yōu)化及光合特性. 過程工程學(xué)報, 2007, 7(6): 1197?1201.

[9] Xue S, Yao CH, Chen ZN, et al. A method of cultivating marine green alga for the accumulation of starch by utilizing carbon dioxide: China patent, 201010522883.4. 2010-10-27.薛松, 姚長洪, 陳兆安, 等. 一種利用二氧化碳培養(yǎng)海洋綠藻積累淀粉的方法: 中國, 201010522883.4. 2010-10-27.

[10] Guo Z, Chen ZA, Lu HB, et al. Enhanced hydrogen photoproduction by marine green microalga Platymonas subcordiformis grown under CO2-supplemented air bubble bioreactor. J Xi’an Jiaotong Univ, 2008, 42(6): 779?783.郭禎, 陳兆安, 陸洪斌, 等. CO2對亞心形扁藻生長及光合放氫的影響. 西安交通大學(xué)學(xué)報, 2008, 42(6): 779?783.

[11] Wang XQ, Miao H, Zhai Y. Study on the methods of alga cells fragmentation. J Tianjin Univ Sci Technol, 2007, 22(1): 22?25.王雪青, 苗惠, 翟燕. 微藻細(xì)胞破碎方法的研究. 天津科技大學(xué)學(xué)報, 2007, 22(1): 21?25.

[12] Zhang CM. Studies on continuous ethanol fermentation with recycling of distillage and impact of by-products on growth and ethanol fermentation of the self-flocculating yeast SPSC01 [D]. Dalian: Dalian University of Technology, 2010.張春明. SPSC01廢液全循環(huán)乙醇連續(xù)發(fā)酵及發(fā)酵副產(chǎn)物對酵母生長和乙醇發(fā)酵的影響研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2010.

[13] Schreiber U, Hormann H, Neubauer C, et al. Assessment of photosystem II photochemical quantum yield by chlorophyll fluorescence quenching analysis. Aust J Plant Physiol, 1995, 22(2): 209?220.

[14] Zhen Y, Chen ZA, Fu YB, et al. Integrated cultivation and photohydrogen production of Tetraselmis subcordiformis in a flat-plate photobioreactor system. Chemical J Chin Univ, 2008, 29(11): 2209?2212.鄭陽, 陳兆安, 傅 彬, 等. 亞心形四爿藻培養(yǎng)和產(chǎn)氫過程一體化平板光生物反應(yīng)系統(tǒng). 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2008, 29(11): 2209?2212.

[15] Behrens PW, Bingham SE, Hoeksema SD, et al. Studies on the incorporation of CO2into starch by Chlorella vulgaris. J Appl Phycol, 1989, 1(2): 123?130.

[16] Tatsumi C, Ogaki M, Tanabe I. Method of obtaining ethanol by the utilization of unicellular green algae: CA, 1073379. 1976-01-06.

[17] Shirai F, Kunii K, Sato C, et al. Cultivation of microalgae in the solution from the desalting process of soy sauce waste treatment and utilization of the algal biomass for ethanol fermentation. World J Microbiol Biotechnol, 1998, 14(6): 839?842.

[18] Bush RA, Hall KM. Process for the production of ethanol from algae: US, WO2007/101172 A2. 2007-09-07.

[19] Ogaki M, Tanaka S, Kawasaki H, et al. Method of producing bio-ethanol: US, US2009/0068715 A1. 2008-08-20.