發(fā)酵性絲孢酵母HWZ004利用水稻秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)油脂

李園園，吳虹，黃超，宗敏華

1 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640

2 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院 應(yīng)用生物催化實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

3 華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院 制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

近年來，隨著化石資源日益枯竭，石油價(jià)格不斷上漲，生物柴油等可再生能源的研究與開發(fā)受到了人們的廣泛關(guān)注。目前生物柴油的制備方法一般以動(dòng)植物油脂為原料，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，且原料與食用油競(jìng)爭(zhēng)，難以持續(xù)大量供應(yīng)。微生物油脂，又稱單細(xì)胞油脂，是微生物生命活動(dòng)中的一種代謝產(chǎn)物。某些微生物如酵母、霉菌、微藻、細(xì)菌在一定條件下，能夠利用碳水化合物、碳?xì)浠衔镒鳛樘荚丛隗w內(nèi)積累大量油脂，有的菌體中油脂含量甚至高達(dá)干菌絲體的 70%以上[1]。大部分微生物油脂的脂肪酸組成和一般植物油相近，以C16和C18系脂肪酸，如棕櫚酸、油酸、亞油酸和硬脂酸為主，因此是一種極具潛力的生物柴油生產(chǎn)原料[2]。

木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，如我國僅農(nóng)作物秸稈每年產(chǎn)量就達(dá)10億t。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素與木質(zhì)素組成，其完全水解后可得到大量可溶性單糖，主要有葡萄糖和木糖，其比例大約為1.5∶1~3∶1。而木糖一般很難被微生物所利用。此外，在木質(zhì)纖維素水解預(yù)處理過程中，一般會(huì)產(chǎn)生乙酸、糠醛和 5-羥甲基糠醛等抑制微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的副產(chǎn)物。因此，目前關(guān)于利用木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)微生物油脂的報(bào)道很少。潘麗霞等[3]通過木糖搖瓶發(fā)酵，從已分離到的產(chǎn)油酵母中篩選到能夠較好利用木糖產(chǎn)油脂的小紅酵母Rhodotorula minuta和粘紅酵母Rhodotorula glutinis各一株，其以脫毒預(yù)處理的蔗渣半纖維素水解液為培養(yǎng)基時(shí)的油脂得率系數(shù)分別為 13.49和 10.28。Chen等[4]采用葡萄糖和木糖比例為 3∶2的限氮混合培養(yǎng)基，從10種油脂酵母中篩選到6株能夠利用木糖產(chǎn)油脂的菌株，其中 Trichosporon cutaneum 2.1374對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中的抑制劑有較好的耐受性。但其在添加20%玉米秸稈完全水解液培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)菌體細(xì)胞中的油脂含量卻不理想 (＜8%)。最近，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，T. fermentans CICC 1368雖然能夠高效利用木糖產(chǎn)油脂[5]，但其在未脫毒的水稻秸稈半纖維素水解液中培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累受到嚴(yán)重抑制，而以脫毒預(yù)處理的水解液為培養(yǎng)基時(shí)卻能夠較好地生長(zhǎng)，發(fā)酵 8 d后的生物量、油脂含量與油脂產(chǎn)量可分別達(dá)到 28.6 g/L、40.1%與11.5 g/L[6]。

為了更有效地利用木質(zhì)纖維素水解液，降低水解液中抑制劑對(duì)微生物的毒性，前人在相關(guān)研究中往往同時(shí)采用 overliming法、濃縮、活性炭或樹脂吸附等方法對(duì)其進(jìn)行脫毒處理，這不但過程繁瑣，而且糖損失較嚴(yán)重。為簡(jiǎn)化脫毒處理，我們分別采用不同濃度的木質(zhì)纖維素水解液對(duì) T. fermentans CICC 1368進(jìn)行馴化，獲得一株對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中抑制劑耐受能力較強(qiáng)的菌株 T. fermentans HWZ004 (其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 CCTCC的保藏號(hào)為M 209060)。在此基礎(chǔ)上，本文采用酸預(yù)處理和酶水解兩步法水解水稻秸稈的半纖維素和纖維素，以降低水解產(chǎn)物中抑制劑含量，簡(jiǎn)化其后的脫毒過程；考察T. fermentans HWZ004利用該水解液發(fā)酵產(chǎn)油脂時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累特性，并進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，提高油脂產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

發(fā)酵性絲孢酵母 Trichosporon fermentans HWZ004，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。來源于 Trichoderma reesei ATCC 26921的纖維素酶 (3.5 FPU/mg) 和Novozyme 188 (720 IU/mL) 購自Sigma公司，糠醛和5-羥甲基糠醛 (HMF) 購自Alfa Aesar公司 (純度＞98%)，其他試劑為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基 (g/L，葡萄糖20，蛋白胨10，酵母提取物10)；pH 6.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：水稻秸稈水解液，蛋白胨1.4，酵母提取物 0.5，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.4，MnSO4·H2O 3.0×10?3，CuSO4·5H2O 0.1×10?3；pH 6.5。

1.3 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將保藏菌種接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)2~3 d后，置于4 ℃冰箱中保存待用。

液體種子培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)菌種接2~3環(huán)到裝有50 mL的YEPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在28 ℃，160 r/min下培養(yǎng)24 h。

搖瓶產(chǎn)脂培養(yǎng)：將適量種子液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于一定溫度、160 r/min下培養(yǎng)1~10 d。

所有數(shù)據(jù)均為2個(gè)平行樣的均值。

1.4 水稻秸稈水解液制備

將水稻秸稈粉碎過40目篩，按1∶10的固液比與2.0 wt%的稀硫酸混合，121 ℃下反應(yīng)1 h后過濾，對(duì)濾液進(jìn)行 overliming法處理，具體操作如下：加入Ca(OH)2，調(diào)節(jié)溶液pH至10.0，沉降1 h后過濾取上清液；接著用5 mol/L H2SO4溶液調(diào)節(jié)溶液pH至5.5；然后按0.1 g/L的量加入無水亞硫酸鈉，煮沸15 min后冷卻過濾，濾液置于4 ℃冰箱待用。固體殘?jiān)?jīng)水洗至中性后，按1∶6的固液比加入2.0 wt%的NaOH溶液中，于50 ℃、200 r/min下振蕩 12 h，過濾、水洗至中性后干燥。所得固體按12∶100的固液比加入到overliming后的酸預(yù)處理水解液中，然后按每克固體加入25 FPU T. reesei纖維素酶和60 IU Novozyme 188，于50 ℃、180 r/min下酶解3 d得水稻秸稈水解液。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量測(cè)定和油脂提取

采用干重法測(cè)定生物量[6]。定期從搖瓶中取出一定量發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，所得菌體用50 mL蒸餾水洗滌2次后冷凍干燥12 h，稱重。以g干菌體/L發(fā)酵液表示菌體生物量。

采用酸熱法抽提干菌體內(nèi)的油脂[6]。以 g油/L發(fā)酵液表示油脂產(chǎn)量，油脂含量為油脂量占生物量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

1.5.2 糖和抑制劑成分分析

采用高效液相色譜 (Waters 515 pump，Waters Corp.，USA) 分析水稻秸稈水解液成分。其中，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙酸的檢測(cè)采用RI檢測(cè)器 (Waters 2410) 和 Aminex HPX-87H 色譜柱(300 mm×7.8 mm，Bio Rad Corp.，USA)，流動(dòng)相為0.005 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫箱和檢測(cè)池溫度分別維持在65 ℃和50 ℃。在此條件下，上述成分的保留時(shí)間分別為 11.890、12.752、13.902、20.002 min?？啡┖?5-羥甲基糠醛的檢測(cè)采用PDA檢測(cè)器 (Waters 996) 和Zorbax SB-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，Agilent Technologies Co. Ltd.，USA)，流動(dòng)相為水∶甲醇 (80∶20，V/V)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，保留時(shí)間分別為6.045 min和4.538 min。

1.5.3 油脂脂肪酸組成分析

參照文獻(xiàn)方法制備微生物油脂的脂肪酸甲酯[7]。采用 GC-2010氣相色譜儀 (日本島津公司)

分析甲酯化產(chǎn)物，色譜條件為：FID檢測(cè)器；毛細(xì)管色譜柱：DB-1 (30.0 m×0.25 mm，美國Agilent公司)；分析條件：氣化室溫度250 ℃，檢測(cè)室溫度280 ℃，柱溫170 ℃，以3 ℃/min的速度升溫至 220 ℃，維持 2 min；載氣為氮?dú)?，流速?8.5 mL/min；分流比為50∶1 (V/V)；進(jìn)樣量1 μL。棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的保留時(shí)間分別為11.004、15.802、15.087、14.871 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩步法水解水稻秸稈

木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法對(duì)水解液的組成影響顯著。在稀酸預(yù)處理過程中，乙酸、糠醛和HMF是最常見的抑制劑，而糠醛和HMF通常被認(rèn)為是抑制微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的主要物質(zhì)[8]。為了降低水解液中抑制劑的種類和濃度，本文選擇了較溫和的稀酸預(yù)處理方法，反應(yīng)時(shí)間僅為1 h。由表1可見，與反應(yīng)2 h的結(jié)果相比[6]，乙酸和糠醛的濃度均大大降低 (0.6 g/L vs 1.4 g/L；0.22 g/L vs 0.5 g/L)。雖然HMF的濃度有所升高 (0.25 g/L vs 0.08 g/L)，但經(jīng)簡(jiǎn)單的overliming法脫毒處理后其降至 0.06 g/L；糠醛的濃度亦從 0.22 g/L降至0.11 g/L。稀酸預(yù)處理的水稻秸稈經(jīng)進(jìn)一步酶水解后水解液中的糖濃度達(dá)到80.8 g/L，可不需濃縮直接用于發(fā)酵。雖然該糖濃度較Chen等[4]報(bào)道的兩步法低，但他們采用的預(yù)處理方法條件更為苛刻(先硫酸浸泡后高溫高壓蒸汽爆破)，會(huì)產(chǎn)生大量的抑制劑，如乙酸、糠醛和 HMF的濃度分別高達(dá)11.58 g/L、0.32 g/L和1.01 g/L。

2.2 T. fermentans HWZ004利用水稻秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)油脂

圖1描述了T. fermentans HWZ004利用上述水解液發(fā)酵產(chǎn)油脂的過程曲線及糖消耗情況。由圖1A可見，細(xì)胞生長(zhǎng)在該水解液中未受到明顯抑制，發(fā)酵第1天的生物量為4.6 g/L，而馴化前的出發(fā)菌株T. fermentans CICC 1368甚至在脫毒后的水稻秸稈半纖維素水解液中仍可觀察到顯著的抑制作用[6]。在 1~8 d內(nèi)，生物量隨時(shí)間增加而增大，第 8~9天變化甚微，隨后生物量開始下降。油脂含量在第 1~2天內(nèi)變化不大，且含量較低，其原因可能是：一方面，油脂一般在氮源消耗殆盡，碳源充足的情況下大量積累，而發(fā)酵初期培養(yǎng)基中的氮源濃度相對(duì)較高，因此油脂合成的量很少；另一方面，水解液中少量抑制劑的存在抑制了細(xì)胞體內(nèi)油脂合成酶的活性，細(xì)胞需要一定時(shí)間來適應(yīng)環(huán)境。第 2天后，油脂含量隨時(shí)間增加而顯著上升，第 7天達(dá)到最大值。此后，隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)增加而降低。圖1B的糖利用情況有助于我們更好地認(rèn)識(shí)上述細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累現(xiàn)象。發(fā)酵前 7天，培養(yǎng)基中有足夠的碳源供給細(xì)胞生長(zhǎng)及油脂合成，第7天，總糖濃度下降至1.9 g/L，此時(shí)，細(xì)胞開始利用體內(nèi)積累的油脂進(jìn)行代謝活動(dòng)。因此，油脂含量下降而生物量略有上升。在解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica、T. fermentans CICC 1368和頭狀絲孢酵母Trichosporon capitatum發(fā)酵產(chǎn)油脂過程中亦觀察到類似現(xiàn)象[5,9-10]。此外，圖 1B表明糖代謝中的葡萄糖效應(yīng)明顯，只有當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)，T. fermentans HWZ004才開始利用木糖和阿拉伯糖。而有趣的是，在上述幾種糖的模擬培養(yǎng)基中卻沒有觀察到類似現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樗庖褐械囊种苿┯绊懥思?xì)胞糖代謝過程中一些關(guān)鍵酶的活性。我們?cè)跈z測(cè)發(fā)酵過程中木糖還原酶的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前5天，水稻秸稈水解液中木糖還原酶的比活約為模擬培養(yǎng)基中的1/4。另一方面，水解液中抑制劑，如乙酸等的存在對(duì)木糖和阿拉伯糖代謝的抑制作用比對(duì)葡萄糖的更強(qiáng)烈[11]。

表1 水稻秸稈水解液組成Table 1 Composition of rice straw hydrolysate after each step of treatment

圖1 T. fermentans HWZ004利用水稻秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)油脂F(xiàn)ig. 1 Production of microbial oil on rice straw hydrolysate by T. fermentans HWZ004. (A) Time course of cell growth and lipid accumulation. (B) Time course of sugar utilization. Culture was performed at 25 °C, pH 6.5 and 160 r/min, inoculum size 10%.

2.3 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件對(duì) T. fermentans HWZ004產(chǎn)油脂的影響

培養(yǎng)基組成對(duì)微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累有顯著影響。如氮源的種類和C/N比直接影響菌體的生長(zhǎng)速度以及油脂的積累情況[5,10]；二價(jià)金屬離子則可能與油脂合成途徑中關(guān)鍵酶蘋果酸酶結(jié)合，通過影響酶結(jié)構(gòu)的完整性從而影響油脂的合成[12-13]。為了更高效地利用水稻秸稈水解液，了解馴化菌株T. fermentans HWZ004與出發(fā)菌株 T. fermentans CICC 1368對(duì)各種營養(yǎng)成分需求的差異，我們研究了氮源及微量元素對(duì)T. fermentans HWZ004產(chǎn)油脂的影響。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛鹊陀?.8 g/L時(shí)，生物量和油脂含量均隨氮源濃度的增加而增大；當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.8 g/L時(shí)，生物量和油脂含量達(dá)到最大值，分別為27.8 g/L和41.4%。其后，隨著蛋白胨濃度繼續(xù)升高，生物量和油脂含量開始下降，而油脂含量的變化較生物量明顯，可能是培養(yǎng)基中的碳氮比超過了其最適范圍，氮源過多導(dǎo)致油脂合成減少。與出發(fā)菌株T. fermentans CICC 1368相比，T. fermentans HWZ004對(duì)外加氮源的需求減少[5]，其原因是水解液中殘留的酶蛋白補(bǔ)充了一部分所需的氮源。對(duì)T. fermentans CICC 1368的研究發(fā)現(xiàn)，只有添加一定量的K+、Mg2+、Mn2+和 Cu2+于合成培養(yǎng)基中，方能獲得高油脂產(chǎn)量。但對(duì)于 T. fermentans HWZ004， 除 了 添 加 極 少 量 的CuSO4·5H2O (0.1×10?3g/L) 可以促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和油脂積累外，其他金屬離子的添加非但不能促進(jìn)油脂的合成，還對(duì)其合成有抑制作用。這是因?yàn)椋湟?，K、P、Mg等是植物細(xì)胞中的大量元素，在秸稈的酸預(yù)處理過程中以無機(jī)鹽的形式進(jìn)入水解液，因此細(xì)胞在生長(zhǎng)和油脂積累過程中無需外加這 3種元素；其二，經(jīng)過Ca(OH)2overliming法處理后，水解液中離子強(qiáng)度較高。

表2是培養(yǎng)條件對(duì)T. fermentans HWZ004產(chǎn)油脂的影響。由表可見，適宜的接種量為5.0%，過高接種量 (＞5.0%) 雖然可進(jìn)一步提高生物量，但油脂含量卻顯著下降。其原因可能是高接種量導(dǎo)致細(xì)胞過快增殖，減少了產(chǎn)物的合成。此外，過高接種量可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中氮源濃度增加 (種子培養(yǎng)基中的氮源濃度較高)，碳氮比下降，不利于油脂積累。與出發(fā)菌株T. fermentans CICC 1368相似[5]，在20 ℃和25 ℃范圍內(nèi)，T. fermentans HWZ004的生物量和油脂含量隨著溫度的升高而增加。25 ℃時(shí)，生物量和油脂含量達(dá)到最大值，分別為25.9 g/L和52.1%。而當(dāng)溫度高于25 ℃時(shí)，生物量和油脂含量隨著溫度的繼續(xù)升高而下降。pH不僅可通過改變細(xì)胞膜電荷和營養(yǎng)物離子化程度來影響微生物對(duì)營養(yǎng)的吸收，而且還影響細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性。表 2的結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH小于7.0時(shí)，生物量和油脂含量隨著pH的增加而增大；當(dāng)pH＞7時(shí)，生物量和油脂含量隨著pH的繼續(xù)增大而緩慢下降；最適pH為7.0。

2.4 油脂脂肪酸組成分析

經(jīng)過上述優(yōu)化后，T. fermentans HWZ004在5%接種量、25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)7 d (培養(yǎng)基組成：水稻秸稈水解液，0.8 g/L蛋白胨、0.1×10?3g/L CuSO4·5H2O，初始pH 7.0) 的生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量分別是26.4 g/L、52.2%和13.8 g/L。此時(shí)，油脂得率系數(shù)為 17.0，大大高于其馴化前以脫毒的水稻秸稈半纖維素水解液為碳源時(shí)的對(duì)應(yīng)值(11.9)[6]。表3歸納了不同微生物菌株以不同工農(nóng)業(yè)廢棄物為原料生產(chǎn)微生物油脂的情況。由該表可知，本研究采用兩步法水解并經(jīng)簡(jiǎn)單 overliming法脫毒處理得到的水稻秸稈水解液是一種很好的碳源，T. fermentans HWZ004以其為培養(yǎng)基發(fā)酵所得的油脂產(chǎn)量最高。

表2 接種量、溫度和培養(yǎng)基初始pH對(duì)T. fermentans HWZ004發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響Table 2 Effect of inoculum size, temperature and initial pH on cell growth and lipid accumulation of T. fermentans HWZ004

表3 不同微生物利用不同來源的碳源生產(chǎn)微生物油脂Table 3 Microbial oil production on different carbon sources by various microorganisms

氣相色譜分析結(jié)果表明，T. fermentans HWZ004所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成與出發(fā)菌株 T. fermentans CICC 1368相似[5-6]，主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸，含量分別為 20.9%、8.7%、65.1%和 5.3%，不飽和脂肪酸含量占 70%以上。該油脂組成與植物油相似，因此可用于生物柴油的生產(chǎn)。

3 結(jié)論

采用溫和的稀酸預(yù)處理及酶水解兩步法可以降低水稻秸稈水解產(chǎn)物中的抑制劑濃度，簡(jiǎn)化脫毒步驟。水解液只需經(jīng)簡(jiǎn)單的 overliming法處理、外加少量氮源和微量CuSO4·5H2O即可滿足T. fermentans HWZ004細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累的營養(yǎng)要求。T. fermentans HWZ004利用水稻秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)油脂的油脂得率系數(shù)達(dá) 17.0，且所得油脂的脂肪酸組成與植物油相似，可用于生物柴油的生產(chǎn)。

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