PCR依賴型方法構(gòu)建高質(zhì)量酵母基因突變文庫

王睿，喻曉蔚，徐巖，郅巖，孔宇

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122

2 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，無錫 214122

酶的體外定向進(jìn)化屬于蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)，它無需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，只需人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制 (隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶[1]。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決理性設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力[2-6]。

酵母是表達(dá)外源基因的最重要的表達(dá)系統(tǒng)之一。酵母作為單細(xì)胞生物，在生產(chǎn)和操作上具有優(yōu)越于細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的易于大規(guī)模擴(kuò)增的特點(diǎn)，又具有真核細(xì)胞對蛋白質(zhì)的翻譯后加工及修飾的作用[7-8]。酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體主要分為2種，即整合型載體和附加型載體。整合型載體不含自主復(fù)制序列，轉(zhuǎn)化入酵母后整合到酵母宿主菌的染色體上，具有穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于工業(yè)化生產(chǎn)。而附加型載體能夠在酵母體內(nèi)自主復(fù)制，達(dá)到較高的拷貝數(shù)，但是在非選擇條件下多不穩(wěn)定[9]。

定向進(jìn)化的研究中常用大腸桿菌為宿主構(gòu)建基因突變文庫，而酵母使用較少。而對于在大腸桿菌表達(dá)體系中表達(dá)效果不好的酶，就需要嘗試其他表達(dá)體系。前期研究表明華根霉脂肪酶在大腸桿菌中表達(dá)無法進(jìn)行翻譯后修飾，比活很低，而無法體現(xiàn)出脂肪酶應(yīng)有的酶學(xué)性質(zhì)，篩選困難[10]；而該脂肪酶在畢赤酵母中具有較高的表達(dá)量，比活與野生型相當(dāng)，能夠反應(yīng)出脂肪酶應(yīng)有的酶學(xué)性質(zhì)[11-12]。但是利用亞克隆法構(gòu)建酵母突變文庫過程繁瑣，步驟包括：目的基因突變；突變基因與表達(dá)載體的酶切處理；重組質(zhì)粒構(gòu)建；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行大量擴(kuò)增；重組質(zhì)粒的提取及酶切線性化；轉(zhuǎn)化酵母，獲得基因突變文庫。上述過程繁瑣、低效、耗時(shí)耗力，極大地?fù)p失了突變基因的容量和豐度，而目的轉(zhuǎn)化子需要從成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)化子中才能篩選得到，因此上述方法不能滿足構(gòu)建酵母整合型基因突變文庫的需要。

本研究建立的構(gòu)建酵母突變文庫的新方法與亞克隆法一樣，都是以構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒能夠與畢赤酵母基因組發(fā)生同源重組為基礎(chǔ)，獲得外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)。但是兩者構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒的過程和原理不同。亞克隆法是在體外構(gòu)建表達(dá)盒：需要在體外獲得可以與酵母基因組進(jìn)行同源重組的完整片段 (即將目的基因經(jīng)過 PCR擴(kuò)增，酶切，與酶切后的表達(dá)載體連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，再擴(kuò)增重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化)，才可以將該片段轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母，與酵母基因組同源重組后獲得突變文庫。而新方法是在體內(nèi)自主構(gòu)建表達(dá)盒：不需要在體外獲得完整的片段，只需要分別擴(kuò)增出目的基因和表達(dá)載體，將其混合轉(zhuǎn)化畢赤酵母，基因片段和載體片段上的同源臂可以在酵母體內(nèi)同源重組形成與亞克隆法體外獲得的完全相同的完整片段，再與酵母基因組同源重組，獲得突變文庫。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，PCR試劑 (TaKaRa公司)，引物，DL2000 DNA Ladder Maker，E10000 DNA Ladder Maker，醋酸鋰/山梨醇 (上海生工有限公司)，YNB，G418，DTT (BIOSHARP)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒 (天根生化科技 (北京) 有限公司)，Plasmid Mini Kit I (OMEGABIO-TEK)，其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli JM109、巴斯德畢赤酵母 Pichia pastoris GS115和華根霉；Rhizopus chinensis CCTCCM201021；由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pPIC9K購自Invitrogen公司；攜帶華根霉脂肪酶基因proRCL的重組質(zhì)粒pPIC9K-proRCL由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

MD：1.34%YNB，4×10?5%生物素，2%葡萄糖。

YPD-G418 (0.5~3 g/L)：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，0.5~3 g/L G418。

BMMY：1%酵母膏，2%蛋白胨，0.5%甲醇，0.1 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 6.0)，1.34% YNB，4×10?5生物素。

BMMYA’：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%甲醇，0.1 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 6.0)，1.34% YNB，4×10?5生物素，2%瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 proRCL的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增

為了使載體片段 pPIC9K與擴(kuò)增基因片段在電轉(zhuǎn)后插入酵母基因組時(shí)能夠有效地同源重組，基因片段與PIC9K必須具有不小于40 bp的同源臂。以重組質(zhì)粒 pPIC9K-proRCL中 proRCL上下游的PIC9K序列為模板，分別設(shè)計(jì)目的片段的上游引物66 bp F和下游引物60 bp R (表1)。其中，上、下游引物分別與pPIC9K有66 bp和60 bp的重疊。

50 μL易錯(cuò)PCR體系如下：5 μL 10×易錯(cuò)PCR緩沖液 (500 mmol/L KCl，70 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，0.1% (W/V，明膠))；0.5 mmol/L dATP/dGTP，2.5 mmol/L dCTP和dTTP；引物各40 pmol；MgCl27 mmol/L；MnCl20.3 mmol/L；Taq DNA聚合酶2.5 U。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 1 min ，59 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物命名為promRCL，經(jīng)DNA純化試劑盒純化。

1.2.2 表達(dá)載體 pPIC9K的擴(kuò)增

載體處理的一般方法是對載體進(jìn)行酶切處理，再與目的基因連接。對 pPIC9K進(jìn)行雙酶切后，可得到一段大小為9 226 bp的片段[6]?？呻p酶切操作耗時(shí)、繁瑣、低效，不能滿足快速高效制備載體的要求。

表1 本研究中用到的引物及其序列Table 1 The primers utilized in this study and primer sequences

本研究實(shí)現(xiàn)了載體的PCR制備，無需酶切。由于需要擴(kuò)增得到末尾不加“A”的載體片段，且需要保證擴(kuò)增片段的高保真性，選擇Prime STAR聚合酶(SP) 進(jìn)行擴(kuò)增。

以質(zhì)粒 pPIC9K為模板，以引物 9K-shortF和9K-shortR (表1) 擴(kuò)增得到9K-short (2 000 bp) 的短片段；同樣以引物9K-longF和9K-longR擴(kuò)增得到9K-long (7 226 bp) 的長片段。

其中，9K-long的PCR擴(kuò)增程序使用兩步法：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 7.5 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min，可達(dá)到較好的擴(kuò)增效果。

將擴(kuò)增片段9K-long和9K-short利用純化試劑盒進(jìn)行純化后備用。

1.2.3 基因與載體同源臂長度對建庫的影響

為考察不同長度同源臂對整個(gè)建庫過程的影響，設(shè)計(jì)不同長度的引物 9K-longF/R 和9K-shortF/R，使目的基因與載體間同源臂的長度分別位于以下區(qū)間：25~40 bp，40~70 bp和＞70 bp。將上述目的基因與載體分別電轉(zhuǎn)，獲得突變文庫，每個(gè)文庫隨機(jī)挑選10個(gè)菌株來測定其陽性重組率。

1.2.4 突變基因proRCL擴(kuò)增片段和表達(dá)載體pPIC9K混合

將9K-long和9K-short片段以等摩爾混合，再與突變基因promRCL片段按照摩爾比10∶1，3∶1，1∶1，1∶3和1∶10的梯度混合均勻，使各梯度基因總量相同。于真空干燥箱濃縮至體積＜1 μL。

1.2.5 載體與基因混合物的電轉(zhuǎn)化

對電轉(zhuǎn)化過程中各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[13]。電轉(zhuǎn)化過程按照取混合均勻的片段加入至80 μL感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)至0.2 cm冰預(yù)冷的電激杯。冰上放置5 min，電壓1 500 V，電容25 μF，電阻200 ?，進(jìn)行電擊。立刻加入1 mL 1 mol/L山梨醇復(fù)蘇，30 ℃培養(yǎng)1 h。將轉(zhuǎn)化液涂布于MD平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，得到突變文庫。

1.2.6 陽性轉(zhuǎn)化子的確定

陽性轉(zhuǎn)化子可以表達(dá)脂肪酶，所以可以在含F(xiàn)ast-blue RR頂層瓊脂的平板上清晰顯色，另外，經(jīng)PCR驗(yàn)證，外源 DNA和載體片段應(yīng)重組為正確的表達(dá)盒并插入到酵母基因組內(nèi)。

將 MD平板上的單菌落用滅菌牙簽挑至YPD-G418 (0.5 g/L)，30 ℃培養(yǎng)2 d。不帶有基因的9K載體與酵母基因組發(fā)生同源重組產(chǎn)生的重組菌也可以在 G418抗性平板上生長。對 MD平板和YPD-G418平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

陽性率=G418抗性平板上的單菌落數(shù)/MD板上的單菌落數(shù)。

進(jìn)行陽性重組率測定實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用常規(guī)PCR而非易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以消除基因突變帶來的酶活的影響。將 MD平板上的單菌落用滅菌牙簽挑至BMMYA’板上，誘導(dǎo)5 d后，F(xiàn)ast-blue RR頂層瓊脂法染色，2 min內(nèi)能夠顯出明顯棕黑色的菌株為重組陽性菌 (脂肪酶可以水解萘酯，水解產(chǎn)物與染料結(jié)合顯色)。重組陽性菌是指帶有脂肪酶基因 proRCL的 9K載體片段與酵母基因組發(fā)生同源重組產(chǎn)生的菌株。

重組率=所有BMMYA’板上的單菌落中可以誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)脂肪酶的單菌落數(shù)/YPD-G418板上的單菌落數(shù)。

若目的基因?yàn)槠渌?，?yīng)選擇其相應(yīng)的酶活測定方法確定陽性重組率。

為了驗(yàn)證電轉(zhuǎn)時(shí)外源 DNA與載體片段是否同源重組為正確的表達(dá)盒并插入到酵母基因組中，提取篩選目的菌株的基因組，以5′AOX和3′AOX為引物 (表1) 進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送往上海生工生物有限公司測序。

1.2.7 PDM構(gòu)建的重組菌的酶活測定

pNPP法測定脂肪酶酶活[14]。比較PDM構(gòu)建的突變文庫與亞克隆方法構(gòu)建的突變文庫，考察庫容量及篩選得到的突變株的酶活、表達(dá)量、熱穩(wěn)定性等其他酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.8 PDM構(gòu)建的突變文庫的篩選

根據(jù)篩選目的，選擇合適的篩選方法對PDM構(gòu)建的突變文庫進(jìn)行篩選。文中分別篩選得到了酶活提高，酶表達(dá)量提高以及酶熱穩(wěn)定性提高的突變株。

篩選酶活提高突變株的方法為：用滅菌牙簽將 MD平板上生長出的 His+轉(zhuǎn)化子復(fù)制到Y(jié)PD和 BMMY平板的相同位置，同時(shí)將對照菌GS115/pPIC9K-proRCL Mut+接種至BMMY平板上。30 ℃培養(yǎng)2 d后，每12 h向BMMY平皿蓋上補(bǔ)加200 μL甲醇誘導(dǎo)重組脂肪酶表達(dá)。誘導(dǎo)2~3 d。向酶活測定底物pNPP中加入0.6%瓊脂，混合均勻后，倒于BMMY平板形成頂層瓊脂。2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯黃色的菌株為初篩目的菌株。相同條件下，對照菌GS115/pPIC9K-proRCL Mut+不能顯示出明顯黃色[14]。再利用 96孔板發(fā)酵法對初篩目的菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

篩選酶表達(dá)量提高突變株的方法為：用滅菌牙簽將MD平板上生長出的His+轉(zhuǎn)化子復(fù)制到 YPD-G418 (0.5 g/L)、YPD-G418 (1 g/L)、YPD-G418 (2 g/L)、YPD-G418 (3 g/L) 平板的相同位置，能在YPD-G418 (0.5 g/L) 平板上生長良好，在另 3塊高濃度的 YPD-G418平板或其中一塊上，也生長到和YPD-G418 (0.5 g/L) 平板上幾乎一樣的大小，即為表達(dá)量提高的初篩目的菌株。再利用 96孔板發(fā)酵法對初篩目的菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

篩選酶熱穩(wěn)定性提高突變株的方法為：用滅菌牙簽將 MD平板上生長出的 His+轉(zhuǎn)化子復(fù)制到BMMYA’平板上和YPD平板的相同位置，同時(shí)將對照菌 GS115/pPIC9K-proRCL Mut+接種至 BMMYA’平板上。30 ℃生長并誘導(dǎo)4~5 d后，平板經(jīng)脂肪酶致死溫度65 ℃處理1 h，冰浴、室溫平衡后，向平板中傾入Fast-blue RR頂層瓊脂。2 min內(nèi)出現(xiàn)明顯褐色的菌株為初篩目的菌株。相同條件下，對照菌不能顯示出明顯褐色。再利用96孔板發(fā)酵法對初篩目的菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 proRCL的易錯(cuò)PCR擴(kuò)增及載體片段pPIC9K的擴(kuò)增

引物66 bpF/60 bpR經(jīng)error-prone PCR擴(kuò)增得到大小為1 218 bp (1 092 bp+66 bp+60 bp) 的proRCL基因片段 (擴(kuò)增片段上下游與載體含有 60 bp和66 bp的重疊序列) (圖 1中 First PCR)。以質(zhì)粒pPIC9K為模板，9K-longF/R和9K-shortF/R為引物分別擴(kuò)增得到兩段大小分別為7 226 bp和2 000 bp的片段 (圖1中Second/Third PCR)。

2.2 載體線性化對轉(zhuǎn)化效率的影響

亞克隆方法中，電轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-proRCL前，需要對其進(jìn)行酶切線性化，才能電轉(zhuǎn)化并與酵母基因組進(jìn)行同源重組。環(huán)狀質(zhì)粒無法重組成功[15]。PDM方法中，也考察了載體線性化對重組效率的影響。PCR擴(kuò)增載體時(shí)，設(shè)計(jì)了 2組實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn) 1：以 pPIC9K-proRCL為模板，利用 9K-shortF和 9K-longF一組引物擴(kuò)增出長為 9 226 bp (2 000 bp+7 226 bp) 的片段；實(shí)驗(yàn)2：利用9K-shortF/9K-shortR和9K-longF/9K-longR兩組引物分別擴(kuò)增長為2 000 bp和7 226 bp的片段。

實(shí)驗(yàn)1對應(yīng)于亞克隆方法中不對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化；實(shí)驗(yàn)2對應(yīng)于亞克隆方法中對表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)酶切線性化。保證2組實(shí)驗(yàn)的基因及載體的量相同，均為基因5 μg (0.5 nmol)，載體片段 5 nmol，混勻并濃縮。此時(shí)混合物濃度約為10 g/L。將80 μL感受態(tài)加入上述2管DNA混合物中，電轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化結(jié)果為：實(shí)驗(yàn)1：MD板上單克隆數(shù)為2個(gè)，均為假陽性；實(shí)驗(yàn)2：4 000~5 000個(gè)，陽性率達(dá)95%。此結(jié)論說明利用亞克隆或PDM的方法構(gòu)建酵母突變文庫時(shí)，表達(dá)載體的線性化都是必需的。

圖1 基于體內(nèi)同源重組構(gòu)建插入型酵母突變文庫的方法 (PDM) 示意圖Fig. 1 Representation of the new method of mutant pool construction (mutant genes inserted into yeast genome directly) based on in vivo homologous recombination (PDM).

2.3 基因與載體同源序列長度對建庫的影響

本實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟是基因與兩段載體同源整合成為一段 DNA，而同源臂長度的選擇成為同源整合能否成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)考察了設(shè)計(jì)不同長度同源臂對整個(gè)建庫過程的影響，結(jié)果如下：

結(jié)果如表 2所示：當(dāng)擴(kuò)增片段和表達(dá)載體的同源臂長度為25~40 bp時(shí)，目的基因PCR擴(kuò)增效果很好，但是和表達(dá)載體混合電轉(zhuǎn)后，重組陽性率很低?？赡苁怯捎谕幢鄣拈L度過短，無法形成表達(dá)盒，導(dǎo)致脂肪酶基因不能插入到酵母基因組內(nèi)。當(dāng)擴(kuò)增片段和表達(dá)載體的同源臂長度＞70 bp時(shí)，雖然重組陽性率非常高，但是PCR擴(kuò)增操作會(huì)變得比較困難，得到基因的量低，純度差，很難滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。而當(dāng)同源臂長度為40~70 bp時(shí)，重組陽性率和 PCR擴(kuò)增效果都具有實(shí)驗(yàn)的可行性，可以低成本、高效率地得到突變文庫，也能保證文庫篩選的效率。本實(shí)驗(yàn)中得到的同源臂的長度為60 bp和66 bp。

2.4 突變基因proRCL的擴(kuò)增片段和pPIC9K片段的混合與電轉(zhuǎn)化

基于體內(nèi)同源重組構(gòu)建酵母突變文庫的方法見圖1。將上述經(jīng)3次PCR擴(kuò)增得到的proRCL基因片段及9K-long和9K-short片段按照一定的摩爾比混合均勻后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母。

進(jìn)入酵母體內(nèi)后，經(jīng)過 4步外源基因可以同源重組進(jìn)酵母基因組。

Step1：基因片段proRCL以及載體片段9K-short和9K-long末端帶有的60 bp (圖1中a) 及66 bp (圖1中b) 重疊序列使該3段DNA發(fā)生同源重組；

Step2：3段基因連接為一段完整的DNA (即線性化后的完整的重組質(zhì)粒)；

Step3：線性化后的完整的重組質(zhì)粒與酵母基因組同源重組；

Step4：外源基因整合進(jìn)入酵母基因組。

2.5 pNPP法考察PDM法突變文庫的轉(zhuǎn)化率和陽性率

考察了目的基因片段與載體片段的不同摩爾比，各摩爾比結(jié)果見表3。

表2 同源臂長度對PCR擴(kuò)增效果和重組陽性率的影響Table 2 The effective of length of homologous sequences on PCR amplification result and positive recombinant ratio

表3 轉(zhuǎn)化率和陽性率表Table 3 Transformation ratio and positive recombinant ratio

如表3所示，在Error-prone PCR products：vector的比例為1∶1、3∶1、10∶1 (摩爾比) 的梯度中，載體的量為0.14 nmol、0.23 nmol和0.29 nmol。轉(zhuǎn)化率變化不明顯，均處在 105數(shù)量級，重組率下降明顯。這是因?yàn)殡S著載體量的增加，未與目的基因進(jìn)行連接的線性化的 9K直接與酵母基因組發(fā)生重組的概率上升。因此，1∶3和1∶10的梯度重組率更低。但是，隨著載體比例增大，陽性重組率，即目的脂肪酶基因正確插入到重組酵母基因組中的概率顯著下降。由此得出，最佳梯度為Error-prone PCR products∶vector=10∶1。再進(jìn)行Fast-blue RR染色平板確定重組菌，其中95%都是含有目的基因的陽性菌株，具有進(jìn)行后續(xù)操作的可行性。

2.6 PDM構(gòu)建的重組菌的PCR鑒定

本實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟是基因與兩段載體同源整合成為一段DNA，而基因與載體是通過同源重組在畢赤酵母體內(nèi)組裝成完整的、能夠正確表達(dá)外源基因的表達(dá)盒，還是進(jìn)行了隨機(jī)整合，可以通過PCR擴(kuò)增及測序來驗(yàn)證。以5′AOX和3′AOX為引物，對文庫中目的菌株的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，可以得到完整的表達(dá)盒 (圖 1中左上圖)。基因測序結(jié)果表明：PDM方法中目的基因與載體的確按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方式重組整合為一段 DNA (該段DNA與亞克隆方法中構(gòu)建的表達(dá)載體線性化后的片段完全相同)。

2.7 PDM 法構(gòu)建的突變文庫與亞克隆法構(gòu)建的突變文庫的比較

分別運(yùn)用亞克隆方法與PDM法構(gòu)建proRCL基因的突變文庫，使電轉(zhuǎn)化時(shí)的目的基因的摩爾數(shù)基本相同。PDM 法中 Error-prone PCR products與 vector的摩爾比為 10∶1。得到的突變文庫比較如下。

由表4得，PDM法構(gòu)建的基因突變文庫的庫容量提高了 20倍，重組陽性率提高至 95%，而建庫時(shí)間不到原來的25%。

2.8 PDM法構(gòu)建得到的突變菌株列表

對PDM法構(gòu)建得到的突變文庫進(jìn)行篩選，得到如下突變菌株 (表 5)，分別為酶活提高，酶表達(dá)量提高以及酶熱穩(wěn)定性提高的突變株。

表5中Mutant1為酶活提高的突變株，突變前后脂肪酶的表達(dá)量變化很小，但突變后脂肪酶的 Km值由原來的 0.304 mmol/(min·mg) 下降為0.258 mmol/(min·mg)，下降了 15%；Kcat值由原來的 1 138 /min提高至 3 250 /min，表明了突變株Mutant1對底物的親合力提高，比活力上升，酶的催化效率獲得了提高。Mutant1是一株酶活提高的突變株。

表6中Mutant2為酶表達(dá)量提高的突變株，突變前后脂肪酶的表達(dá)量提高了3倍，Kcat值由原來的1 138 /min提高至3 520 /min，也是提高約3倍，表明 mutant2的酶活提高基本是因?yàn)楸磉_(dá)量的提高引起的，而比活力沒有提高。Mutant2是一株酶表達(dá)量提高的突變株。

表7中Mutant3為熱穩(wěn)定提高的突變株，突變前后脂肪酶的表達(dá)量和比活變化不大，Tm由原來的61 ℃提高至67.5 ℃，突變酶在65 ℃和70 ℃下的半衰期分別提高21倍和4.2倍，在75 ℃的半衰期也達(dá)到了7.5 min。Mutant3是一株酶熱穩(wěn)定性提高的突變株。

表4 亞克隆方法與PDM方法構(gòu)建的突變文庫比較Table 4 Comparison of mutant pools built by sub-clone method and PDM

表5 出發(fā)菌株和酶活突變菌株的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和蛋白濃度Table 5 Kinetic parameters and protein concentrations of parent strain and enzymatic mutant

表6 出發(fā)菌株和表達(dá)量突變菌株的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和蛋白濃度Table 6 Kinetic parameters and protein concentrations of parent strain and mutant of expression level

表7 出發(fā)菌株和熱穩(wěn)定性突變菌株的性質(zhì)Table 7 Characters of parent strain and mutant of thermostability

圖2 亞克隆法構(gòu)建酵母突變文庫的方法與PDM方法的比較Fig. 2 Comparison of sub-cloned mutant pool construction method and PDM.

3 討論

由圖2得出，PDM方法效率高，操作方便：在構(gòu)建得到重組表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，整個(gè)建庫步驟只需要一次易錯(cuò) PCR、載體酶切和電轉(zhuǎn)化過程，省略了傳統(tǒng)構(gòu)建過程中連接、突變質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、提取質(zhì)粒等繁瑣而且耗時(shí)的工作，將建庫周期由2周縮短為3 d。另外，由于該方法構(gòu)建酵母基因突變文庫不需要任何亞克隆步驟，降低了亞克隆步驟帶來的突變基因容量與豐度的損失，庫容量從傳統(tǒng)的103~104提高到105以上。最后，該方法還具有材料與方法上的通用性，可廣泛用于各種可以在酵母中獲得表達(dá)的目標(biāo)基因。

在釀酒酵母中Shao等利用“DNA ASSEMBLER”同源重組的方法構(gòu)建了長度超過 19 kb的代謝途徑[16]。本研究在畢赤酵母中成功利用體內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了快速高效的酵母整合型基因突變文庫的方法。

此類方法中，決定實(shí)驗(yàn)成敗的第1個(gè)重要因素是同源臂的長度。比如在“DNA ASSEMBLER”的方法中，隨著需要同時(shí)插入基因組中基因數(shù)目的增加，同源臂的長度需隨之增加，否則正確組裝表達(dá)盒的概率就會(huì)下降。第2個(gè)因素是目的基因與載體PCR片段的摩爾比，摩爾比不僅與組裝效率直接相關(guān)，而且還可以通過控制，來實(shí)現(xiàn)其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

PDM 法是在畢赤酵母體內(nèi)構(gòu)建基因突變文庫的非常有效的方法，但它的應(yīng)用不止于此。還可以利用PDM法向畢赤酵母基因組插入代謝途徑；也可以獲得外源基因在畢赤酵母體內(nèi)的多拷貝插入等。后者可以通過控制 PDM 中目的基因與載體的比值來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)目的基因與載體片段的摩爾比達(dá)到15∶1的時(shí)候，就很容易出現(xiàn)多基因串聯(lián)形成的表達(dá)盒并插入基因組的情況，且隨著摩爾比增加，表達(dá)盒中串聯(lián)的基因數(shù)也隨之增加。因此PDM法可高效的獲得多拷貝克隆，且所需拷貝數(shù)還可以通過載體與基因的摩爾比進(jìn)行控制，具體的拷貝數(shù)可以通過熒光定量的方法進(jìn)行檢測[17-20]。由此可見，PDM及其類似方法在利用酵母進(jìn)行分子生物學(xué)研究的領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力非常巨大。

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