可溶性人類白細胞抗原F和分化簇8α同二聚體的表達、純化與相互作用

羅開華，樊崢，李宏濱，劉一葦

中國科學院微生物研究所，北京 100101

主要組織相容性抗原復合物Ⅰ類分子 (Major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC Ⅰ) 分為典型 MHC Ⅰ類分子 (MHC Ⅰa) 和非典型MHC Ⅰ類分子 (MHC Ⅰb)[1-2]。MHC Ⅰa分子表達在大多數(shù)體細胞表面，它們將抗原多肽呈遞給 T細胞參與天然免疫反應。MHC Ⅰb分子的功能與免疫調節(jié)相關，主要通過與免疫抑制受體的相互作用來調節(jié)T細胞活性。在人體中，MHC Ⅰb主要分為3類基因：HLA-E、HLA-F和HLA-G[3-5]。

HLA-E在機體組織中廣泛表達，它結合的多肽大部分來自其他MHC分子的前導序列。HLA-E通過與NK細胞和T細胞亞群表面表達的CD94/NKG2受體相互作用產生免疫抑制效應[6-10]。HLA-G 是一種在母嬰絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞 (EVTs) 表面大量表達的基因，它通過與免疫細胞表面表達的免疫球蛋白樣轉錄分子2 (Immunoglobulin-like transcript 2，ILT2) 和ILT4抑制受體相互作用從而誘導母嬰免疫耐受[11-13]。與其他的 MHC Ⅰ類分子相比，HLA-F基因在靈長類動物中是高度保守的，因此 HLA-F可能在免疫系統(tǒng)中具有重要功能[14-15]。絕大多數(shù)MHCⅠ類分子與 β2-微球蛋白 (β2-microglobulin，β2m) 和抗原多肽形成 MHC∶β2m∶多肽的三元復合物，抗原多肽是T細胞受體 (T cell receptor，TCR)的結合識別部位，特異的抗原多肽將誘導特異性免疫反應。HLA-F與β2m形成一個二元復合物，并不結合抗原多肽，因此HLA-F不能引起T細胞針對特定抗原的免疫反應[16-17]。雖然 HLA-F被證明與ILT2、ILT4和開放構象的MHC具有相互作用，但其功能仍然未被完全闡明[18]。

CD8α的二元復合物CD8αα是免疫共受體分子，MHC Ⅰ類分子只有同時結合TCR和CD8αα才能激活 T細胞產生免疫反應[19]。MHC Ⅰ類分子的三元復合物能夠與CD8αα結合，而HLA-F是否與CD8αα相互作用尚未見文獻報道。本研究對HLA-F和CD8α基因序列進行同義突變，重組后的基因以蛋白包涵體形式表達，通過稀釋法復性后用凝膠過濾層析和離子交換法純化，通過凝膠過濾層析和Native-PAGE研究HLA-F與CD8αα相互作用。

1 材料與方法

1.1 N端序列突變及突變序列擴增

從質粒載體中擴增出不含信號序列和跨膜結構域的HLA-F序列 (成熟蛋白1-280aa) 和CD8α (成熟蛋白1-114aa) 及全長β2m序列。攜帶HLA-F基因全序列的 pOTB7載體和含全序列的 β2m、CD8α的pCMV-SPORT6質粒購于Proteintech公司。預實驗結果表明，直接將HLA-F與CD8α編碼序列重組進入pET21a (Invitrogen，美國) 質粒無法獲得目的蛋白的大量表達。分析發(fā)現(xiàn)HLA-F和CD8α序列的N端編碼區(qū)含有大腸桿菌稀有密碼子。稀有密碼子對大腸桿菌表達具有重要影響，突變稀有密碼子能顯著提高外源蛋白的表達水平[20]。按圖1所示，設計N端同義突變引物，PCR擴增出突變序列，將突變后的序列重組到pET21a質粒中，篩選陽性克隆并測序。

1.2 目的蛋白的表達及細胞破碎

分別將攜帶HLA-F、CD8α及β2m的pET21a質粒轉化大腸桿菌 BL21感受態(tài)細胞。挑取平板上的單菌落接種于5 mL含氨芐青霉素 (Amp) 的LB 培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后接種于500 mL含Amp的LB進行搖瓶培養(yǎng)，37 ℃振蕩3 h后加入IPTG (德國，Merck) 至終濃度為0.001 mol/L，誘導表達15 h后取樣，SDS-PAGE 檢測。4 000 r/min離心10 min收集菌體，超聲破碎后 12 000 r/min離心 10 min，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達量及在上清和沉淀中的分布。

圖1 CD8α和HLA-F基因N端突變前后序列比對結果Fig. 1 Sequences alignment figure of CD8α and HLA-F with their N terminal mutation.

1.3 包涵體的提取與溶解

SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白均以包涵體形式表達。分別將 HLA-F、CD8α及 β2m誘導表達后的菌液4 000 r/min離心10 min收集菌體，加入50 mL PBS (pH 7.4，137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，4.3 mmol/L Na2HPO4，1.4 mmol/L KH2PO4) 吹打重懸離心沉淀物。超聲破碎 (400 W 100次)，12 000 r/min離心 10 min收集沉淀。用包涵體洗滌液 (0.5% Triton-100，50 mmol/L Tris (pH 8.0)，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L二硫蘇糖醇) 反復洗滌純化顆粒沉淀物。稱量包涵體沉淀，用包涵體溶解液溶解沉淀 (pH 8.0，6 mol/L鹽酸胍，10%甘油，50 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L二硫蘇糖醇) 使包涵體蛋白濃度達到30 g/L。SDS-PAGE檢測和分析提取的包涵體蛋白。

1.4 包涵體蛋白復性

溶解的HLA-F、β2m和CD8α包涵體蛋白分別采用稀釋法復性。把120 mg β2m滴入500 mL復性緩沖液 (pH 8.0，400 mmol/L L-精氨酸，100 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L氧化型谷胱甘肽，5 mmol/L 還原型谷胱甘肽)，4 ℃攪拌1 h后滴入360 mg的HLA-F。攪拌12 h后靜置24 h，將復性液用切向流系統(tǒng) (Millipore，法國) 濃縮，隨后用截留分子量5 kDa的超濾離心管離心濃縮。

1.5 復性蛋白的純化

濃縮后的蛋白復性緩沖液在超濾離心管中置換成分子篩緩沖液 (pH 8.0，10 mmol Tris，150 mmol NaCl，1 mmol/L EDTA)。換液后的HLA-F，CD8αα溶液分別經Superdex200凝膠層析柱 (GE，美國) 純化。收集分離的蛋白在超濾離心管中濃縮后換成離子交換緩沖液 (10 mmol Tris) 通過Q XL離子交換層析柱 (GE，美國) 進一步純化。

1.6 HLA-F與CD8αα相互作用

離子交換分離產物超濾濃縮后置換成分子篩緩沖液，凝膠過濾層析分別分析HLA-F和CD8αα?；厥者^濾產物濃縮至500 μL，將HLA-F和CD8αα混勻，靜置15 min后用凝膠柱層析分析。HLA-F、CD8αα及HLA-F/CD8αα混合物凝膠過濾層析圖采用UNICORN軟件 (GE，美國) 分析和比較。將離子交換純化濃縮后的 HLA-F和 CD8αα按1∶1比例混合靜置 15 min，10% Native-PAGE (pH 8.8) 120 V電泳約 2.5 h，采用考馬斯亮藍對Native膠染色。

2 結果與分析

2.1 序列擴增及PCR突變結果

從質粒載體中成功擴增出 HLA-F (831 bp)、CD8α (342 bp)、β2m (300 bp) 片段。用突變引物擴增CD8α直接得到突變產物，HLA-F突變引物PCR出現(xiàn)了 3條條帶，回收測序后發(fā)現(xiàn)分子量最大的條帶是正確突變產物，將正確突變產物擴增后與突變PCR產物對比電泳如圖2所示。

對PCR驗證陽性克隆結果測序后發(fā)現(xiàn)目的基因序列成功重組進入pET21a質粒。

2.2 目的蛋白的成功表達

攜帶重組pET21a質粒的大腸桿菌BL21菌株經IPTG誘導后，目的蛋白得到成功表達。如圖3所示，IPTG誘導前后目的蛋白表達量出現(xiàn)了顯著變化。除β2m外HLA-F和CD8α在IPTG誘導前都無目的蛋白表達。

圖2 HLA-F突變引物PCRFig. 2 The PCR amplification figure of HLA-F with mutated primer. First PCR amplified out three bands, correct sequence was amplified from longer sequence after sequencing. 1?3: correct sequence; 4?6: first step PCR result.

圖3 IPTG誘導前后HLA-F、β2m和CD8α蛋白電泳圖Fig. 3 The expression of HLA-F, CD8α and β2m were induced by IPTG. 1: HLA-F before IPTG added; 2: HLA-F after IPTG added; 3: β2m before IPTG added; 4: β2m after IPTG added; 5: CD8α before IPTG added; 6: CD8α after IPTG added.

2.3 包涵體蛋白的提取結果

包涵體蛋白電泳結果 (圖 4) 顯示成功提取了目的蛋白。由圖中可以看出盡管經過了反復洗滌純化，包涵體電泳條帶仍含有大量的菌體蛋白。

2.4 HLA-F、CD8αα純化及相互作用結果

分子篩純化和離子交換純化結果顯示蛋白復性成功。如圖5顯示產物以單峰洗脫，SDS-PAGE也證明得到了純度較高的HLA-F和CD8αα，其中左圖33 kDa處為 HLA-F，11 kDa處為 β2m；右圖為CD8αα，分子量為13 kDa。相對于HLA-F，CD8αα帶電荷較少，在鹽濃度較低條件洗脫。

HLA-F、CD8αα與HLA-F/CD8αα混合物凝膠過濾層析結果如圖6所示。

如果HLA-F和CD8αα發(fā)生相互作用，則新形成的 HLA-F/CD8αα復合物在凝膠層析時保留時間將縮短?；旌衔锏纳V圖將會出現(xiàn)復合物色譜峰或者原來HLA-F色譜峰向左偏移，而柱上保留較長的CD8αα峰將不會出現(xiàn)明顯的變化。以純化的CD8αα和混合物中CD8αα峰的相對位置之差作為內參，第一個色譜峰相對于HLA-F的峰出現(xiàn)了0.5 mL的偏移。由此推測HLA-F與CD8αα可能具有相互作用。

圖4 CD8α、HLA-F與β2m包涵體蛋白電泳圖Fig. 4 The SDS-PAGE figure of CD8α, HLA-F and β2m inclusion body proteins. 1: CD8α iinclusion body; 2: HLA-F inclusion body; 3: β2m inclusion body.

圖5 CD8αα與HLA-F的離子交換純化結果Fig. 5 The purification of HLA-F and CD8αα. left: ion exchange figure of HLA-F; right: ion exchange figure of CD8αα.

圖6 HLA-F、CD8αα以及HLA-F/CD8αα凝膠過濾層析結果比較圖Fig. 6 The Gel-Filtration figure of HLA-F, CD8αα and HLA-F/CD8αα. Peak 72.46 mL is of HLA-F; peak 92.65 mL is CD8αα; peak 71.50 mL and 92.26 mL are the peaks of HLA-F/ CD8αα mixture. CD8αα peak move from 92.65 mL to 92.26 mL while the HLA-F peak move from 72.46 mL to 71.50 mL. Taking CD8αα peak as internal reference, the retention time of HLA-F becomes shorter after mixed with CD8αα.

圖7 HLA-F、CD8αα以及HLA-F/CD8αα的非變性蛋白電泳圖Fig. 7 The Native-PAGE figure of CD8αα, HLA-F and CD8αα/HLA-F. Purified CD8αα and HLA-F were mixed at the ratio of 1:1. Native-PAGE was performed in 10% gel at pH 8.8. 1: CD8αα; 2: HLA-F; 3: mixture of CD8αα and HLA-F. There is a new band appear in mixture lane.

另外，通過Native-PAGE檢測，進一步驗證了上述推測。如圖7所示，在pH 8.8 的Native膠上CD8αα所帶電荷少，電泳速度較HLA-F慢，混合物在HLA-F與CD8αα條帶之間位置處出現(xiàn)了新的條帶。新出現(xiàn)的條帶可能是由HLA-F與CD8αα相互作用產生的復合物。

3 討論

稀有密碼子對外源基因在大腸桿菌體的表達具有重大的影響，尤其是序列N端稀有密碼子會抑制外源蛋白的表達。這可能由于核糖體無法在稀有密碼子區(qū)域引發(fā)蛋白合成有關，也有可能與mRNA的二級結構有關[21]。這個特點可能是原核生物對外源核酸序列的一種自我保護機制。本實驗對基因N端序列稀有密碼子進行突變后顯著提高了外源蛋白在大腸桿菌的表達水平。

溶解包涵體時，包涵體的溶解性與所用變性劑的強度具有十分顯著的關系，之所以采用鹽酸胍作為變性劑是因為之前的實驗表明：尿素不能完全溶解CD8α包涵體，所得的包涵體溶解液混濁。鹽酸胍變性能力較尿素強能夠完全溶解包涵體沉淀。此外pH值和變性劑濃度對包涵體的溶解有較大影響[21]。同樣，pH值對蛋白復性也有很大的影響。CD8α復性過程中需要嚴格控制pH，因為復性液的pH接近CD8α的等電點 (pI=8.43)，濃縮和換液過程必須緩慢進行，溶液pH的快速變化容易導致復性蛋白發(fā)生絮凝和沉淀。

凝膠過濾層析分析HLA-F與CD8αα相互作用時，混合物的峰扣除了內參后偏移量不大。分析認為可能是由于superdex 200分子篩柱對4~7 kDa蛋白質分子的分辨率有限，故偏移的幅度較小。Native-PAGE膠圖中，混合物電泳條帶出現(xiàn)彌散，一方面是由于上樣量偏大所致；另一方面可能由于蛋白結合是動態(tài)平衡的過程，復合物在電泳過程發(fā)生部分解離，解離的CD8αα移動變慢使復合物條帶上方出現(xiàn)彌散。HLA-F條帶變化也證明了這個推測，由復合條帶十分靠近 HLA-F，解離的 HLA-F使HLA-F條帶變濃。

HLA-F與其他MHC分子的關鍵不同點在于它與β2m形成二元復合物，MHC結合的多肽參與細胞免疫識別過程。抗原多肽被 T細胞受體 (TCR) 識別而引發(fā)特異的免疫反應，其中CD8αα參與該識別過程。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-F與CD8αα可能具有相互作用，沒有結合抗原多肽HLA-F與CD8αα發(fā)生相互作用必然會影響CD8αα與其他結合多肽的MHC分子的結合，從而影響抗原多肽的呈遞。從本研究的實驗結果推測HLA-F可能參與免疫T細胞TCR識別抗原的調節(jié)過程。此結論需要進一步深入研究和量化分析。

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