促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素基因敲除小鼠的繁殖與基因型鑒定*

王海燕,劉 慶,鐘河江,楊 策,黃蘇娜,嚴(yán) 軍,蔣建新

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第四研究室/全軍交通醫(yī)學(xué)研究所/全軍交通傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400042）

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalam ic-pituitaryad renal,HPA)軸最重要的調(diào)節(jié)因子之一,能刺激垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素(ad renocorticotropic hormone,ACTH)細(xì)胞的阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)基因表達(dá),調(diào)控機(jī)體糖皮質(zhì)激素分泌水平[1-3]。作為研究應(yīng)激后神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)和天然免疫功能關(guān)系的重要模式動(dòng)物,CRH基因敲除(knockout,KO)小鼠為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源性CRH在免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)中的作用提供了有力的工具[4-5]。然而,國(guó)內(nèi)利用CRH KO小鼠進(jìn)行相關(guān)研究的報(bào)道還不多。由于CRH KO小鼠的飼養(yǎng)和繁殖難度與常規(guī)小鼠不同,而獲取一定數(shù)量的CRH KO小鼠是探討HPA軸在神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)中作用的前提和基礎(chǔ),因此,本課題在引進(jìn)CRH KO小鼠的同時(shí),對(duì)該模式動(dòng)物的飼養(yǎng)、保種和基因分型等方面的特點(diǎn)和規(guī)律進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CRH KO雜合子型(CRH+/-)小鼠(雄鼠5只、雌鼠2只)購(gòu)自美國(guó) Jackson實(shí)驗(yàn)室。

1.2 基因敲除小鼠的建立 親代雜合子小鼠為C57BL/6J種系背景。通過(guò)同源重組的方式將來(lái)源于129S2/SvPas小鼠的胚胎干細(xì)胞-D3株(embryonic stem cells-D3,ES-D3)中的目的基因(CRH)進(jìn)行突變,再將突變的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem ce lls,ES)注射入C57BL/6J小鼠胚胎中以獲得嵌合小鼠,通過(guò)對(duì)嵌合小鼠近交繁殖獲得雜合子型(CRH+/-)、野生純合子型(CRH+/+)及CRH KO純合子型(CRH-/-)小鼠。

1.3 CRH KO小鼠的飼養(yǎng)與繁殖 CRH KO小鼠的飼養(yǎng)和繁殖按照無(wú)特定病原(specific pathogen free,SPF)級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)在層流隔離環(huán)境飼養(yǎng),室內(nèi)溫度控制在20～26℃,濕度50%～60%,照明采取12 h晝夜交替的方式。小鼠的飼料由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制。飼養(yǎng)期間密切觀察小鼠生長(zhǎng)情況。采用70～80 d齡CRH+/-雄性小鼠與雌性小鼠按1∶1間歇同籠兄妹近親繁殖方法,連續(xù)生產(chǎn)4～5胎,子鼠21 d后離乳,離乳后種鼠亦同籠交配。采用第2胎生產(chǎn)動(dòng)物保種。繁殖出CRH+/+、CRH+/-及CRH-/-小鼠,并記錄小鼠的體質(zhì)量變化情況。

1.4 小鼠尾部基因組DNA的提取 取出生后10 d左右的幼鼠,剪趾編號(hào)。剪取幼鼠尾尖0.2～0.5 cm,加入組織裂解液56℃孵育過(guò)夜;6 mol/L飽和NaCl和無(wú)水乙醇常規(guī)抽提DNA;室溫干燥后,加三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸[tris(hydroxymethy l)aminomethane-ethy lene diam inetetraacetic acid,TE]緩沖液溶解,采用分光光度法對(duì)提取的小鼠基因組DNA進(jìn)行定量。

1.5 基因鑒定引物及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 引物序列:oIM R0612:5'-GAG CTT ACA CAT TTC GTC C-3';oIM R0613:5'-GCT CAG CAA GCT CAC AGC AA-3';oIM R0510:5'-ATC GCC TTC TTG ACG AGT TC-3'。其中 oIM R0612和 oIM R0613引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為437 bp,用于檢測(cè)CRH+/+,而oIMR0612和o IMR0510引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約600 bp,用于檢測(cè)CRH-/-。PCR擴(kuò)增參數(shù):94℃預(yù)變性4 m in后,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸40 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸 8 min。2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物并分析。上述試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.6 3種基因型小鼠不同組織中CRH的分布檢測(cè) 收集成年CRH+/+、CRH+/-及CRH-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,計(jì)數(shù)后接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,常規(guī)孵育2 h后,取貼壁細(xì)胞提取總RNA。同時(shí)分離提取小鼠下丘腦、肝臟、胸腺和脾臟組織總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR,RTPCR)檢測(cè)不同組織中CRHm RNA的表達(dá)。PCR引物同1.5中的o IMR612和oIMR613引物,PCR方法同1.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用單向方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)判定差異的顯著性,并運(yùn)用O rigin Pro 7.5軟件作圖。采用Kap lein-Meier方法分析生存曲線,應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)比較各基因型小鼠的生存率。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠基因型的鑒定 應(yīng)用3個(gè)特異性引物可鑒別3種不同基因型小鼠,其中泳道1僅出現(xiàn)600 bp條帶,故幼鼠1基因型為CRH-/-;泳道3、5僅出現(xiàn)437 bp條帶,故幼鼠3和幼鼠5基因型為 CRH+/+;泳道 2、4、6～ 8分別出現(xiàn) 437、600 bp兩條帶,表明幼鼠2、4、6～8的基因型為CRH+/-,見(jiàn)圖1。

2.2 3種基因型小鼠的繁殖情況 通過(guò)雜合子小鼠配對(duì),本實(shí)驗(yàn)室成功地繁殖出1 474只子代小鼠,通過(guò)PCR方法鑒定小鼠基因型,結(jié)果顯示CRH+/+、CRH+/-、CRH-/-小鼠所占比例大約為3∶5∶1(CRH+/+小鼠占34.87%,CRH+/-小鼠占54.48%,CRH-/-小鼠占10.65%)。

2.3 CRH KO對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀況的影響 相對(duì)CRH+/+和CRH+/-小鼠而言,早期所得CRH-/-小鼠與其同窩小鼠體型相當(dāng),在出生10 d及30 d時(shí),CRH-/-小鼠體質(zhì)量與CRH+/+及CRH+/-小鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖2。提示以CRH+/-小鼠為種鼠所繁殖的CRH-/-小鼠出生后在無(wú)糖皮質(zhì)激素補(bǔ)充的情況下仍能健康成長(zhǎng),并且,成年后的CRH-/-小鼠與CRH+/+及CRH+/-小鼠相比,體質(zhì)量、生長(zhǎng)狀態(tài)及活動(dòng)等均表現(xiàn)正常,無(wú)表型差異。但隨著繁殖代數(shù)的增加而逐漸呈現(xiàn)出較明顯的生長(zhǎng)遲緩現(xiàn)象,特別是出生后1個(gè)月內(nèi)表現(xiàn)為個(gè)頭矮小,運(yùn)動(dòng)能力弱,生活狀態(tài)差,CRH-/-小鼠的體質(zhì)量顯著低于同期的CRH+/+及CRH+/-小鼠。后2類基因型小鼠均表現(xiàn)如常,無(wú)表型差異。

圖1 3種基因型小鼠基因組DNA的PCR結(jié)果

圖2 3種基因型小鼠出生后10、30 d體質(zhì)量比較(±s)

2.4 3種基因型小鼠不同組織中CRHmRNA的分布情況檢測(cè)3種基因型小鼠下丘腦、肝、胸腺、脾及腹腔巨噬細(xì)胞CRHm RNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)CRH+/+及CRH+/-小鼠不同組織中均有CRHmRNA表達(dá),但 CRH-/-小鼠無(wú)CRHm RNA表達(dá),見(jiàn)圖3。進(jìn)一步證實(shí)CRH-/-小鼠不同組織中CRHm RNA表達(dá)的缺失。

圖3 3種基因型小鼠不同組織中CRH mRNA的表達(dá)

2.5 3種基因型小鼠生存率分析 CRH+/-小鼠與CRH+/+小鼠的存活率基本相似,而在2～3周時(shí),CRH-/-小鼠較另外2種基因型小鼠的存活率明顯下降,第4周后其存活率才基本穩(wěn)定,見(jiàn)圖4。

圖4 3種基因型小鼠生存率分析結(jié)果

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的基本手段,借助遺傳學(xué)手段研究各種基因突變小鼠已成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究最有力的方法之一,CRH KO小鼠模型的建立有助于進(jìn)一步了解糖皮質(zhì)激素在H PA軸系統(tǒng)中的活性機(jī)制和在生殖及免疫調(diào)節(jié)中的作用[6-8]。由于CRH KO小鼠在所有發(fā)育階段組織中的CRH功能完全丟失,因此,它可提供CRH缺失的在體評(píng)估方法[6]。

有研究表明CRH+/-小鼠與CRH+/+小鼠在所有參數(shù)上表現(xiàn)完全相同并具有繁殖能力,通過(guò)CRH+/-小鼠交配所獲得的首批4周齡的266只小鼠中,各型小鼠獲得率與孟德?tīng)柋嚷氏喾?。CRH+/-小鼠交配產(chǎn)生的CRH-/-小鼠具有正常的生存能力,而且,CRH-/-小鼠與同窩CRH+/+小鼠或CRH+/-小鼠相比,其各項(xiàng)指標(biāo)如大小、活性及一般行為等均無(wú)明顯差異[9]。CRH+/-小鼠與CRH+/+小鼠的存活率基本相似,而CRH-/-小鼠較另外2種基因型小鼠存活率在2～3周時(shí)明顯下降,第4周后其存活率才基本穩(wěn)定,盡管CRH-/-小鼠具有很低的基礎(chǔ)糖皮質(zhì)激素水平,但其仍具有生育能力和正常壽命[6,10]。

本研究對(duì)引進(jìn)的CRH KO小鼠也采用CRH+/-小鼠交配的繁殖方式,并獲得一定數(shù)量的CRH KO小鼠。但所獲各基因型小鼠的比率與上述報(bào)道略有出入,純合子小鼠獲得率較低。推測(cè)其原因可能為:(1)CRH是HPA軸在應(yīng)激時(shí)激活的主要中介者,內(nèi)源性CRH的缺乏可能導(dǎo)致CRH-/-小鼠死于胚胎期,或于出生后數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天后死亡,進(jìn)而導(dǎo)致難以觀察新生鼠的表型,更無(wú)從統(tǒng)計(jì)該表型的準(zhǔn)確獲得率,造成獲得率低下的“假象”。(2)本研究中飼養(yǎng)的小鼠繁殖代數(shù)較多,而近交系小鼠隨著近親交配繁殖代數(shù)的增加,其基因純合率不斷提高,導(dǎo)致近親衰退,抵抗力和生育力下降[11]。(3)目前基因敲除的結(jié)果忽略了背景基因的作用,由于所敲除基因的缺失,動(dòng)物機(jī)體可能產(chǎn)生一種雪崩式的代償過(guò)程,引起基因的第二次改變[12]。除遺傳背景外,還有其他許多因素使基因敲除結(jié)果復(fù)雜化,由于基因突變體在體內(nèi)所有組織發(fā)育的過(guò)程都會(huì)丟失,因此,不能排除其他器官缺陷參與表型改變的可能性[13]。CRH目的基因的缺失與某個(gè)或某些背景基因的協(xié)同作用可導(dǎo)致CRH KO小鼠的出生率低、死亡率高及生長(zhǎng)遲緩等現(xiàn)象。

引進(jìn)的小鼠系美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室采用冷凍胚胎復(fù)蘇的方法所獲得。雖然通過(guò)兄妹近親繁殖法獲得各型CRH KO小鼠可隨時(shí)保障實(shí)驗(yàn)的需要,但不可避免地造成其近親衰退。為了消除背景的混淆效應(yīng)及糾正近親衰退,一個(gè)經(jīng)典的方法是回交降低背景基因發(fā)揮作用的可能性[11,14]。經(jīng)過(guò)6代回交后,任何遺傳背景對(duì)基因表達(dá)的影響將可通過(guò)與正常C57BL/6J或129S2/SvPas小鼠的比較而得到控制[6,15]。故擬下一步引進(jìn)129S2/SvPas小鼠與CRH+/-交配,以恢復(fù)后者的繁殖及子代存活率。

本研究在美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室提供的PCR方法基礎(chǔ)上優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行基因型篩選,結(jié)果非常穩(wěn)定。而對(duì)各基因型小鼠下丘腦、肝、胸腺、脾及腹腔巨噬細(xì)胞中CRHm RNA表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果,也進(jìn)一步證實(shí)了PCR鑒定結(jié)果的正確性。另外還發(fā)現(xiàn)CRH+/-小鼠的CRHmRNA表達(dá)水平略低于CRH+/+小鼠,并且CRHmRNA在組織器官間表達(dá)水平不完全相同,提示其在不同組織器官中的作用可能存在差異。

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