• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甲醇濃度對畢赤酵母表達重組人復(fù)合α干擾素分離純化得率的影響

    2011-02-09 09:36:48吳丹儲炬王永紅莊英萍張嗣良
    生物工程學(xué)報 2011年12期
    關(guān)鍵詞:二硫鍵泳道電泳

    吳丹,儲炬,王永紅,莊英萍,張嗣良

    1 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,無錫 214122

    2 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室,上海 200237

    重組人復(fù)合 α干擾素 (cIFN) 是一種氨基酸序列重組的非天然存在的Ⅰ型α干擾素。是由Amgen公司的研究者對當(dāng)時已知的13種人α干擾素的序列進行比較研究,把出現(xiàn)頻率最高的氨基酸分配到各個相應(yīng)的位置上,并對個別氨基酸進行了修改,得到了由166個氨基酸組成的復(fù)合α干擾素[1]。復(fù)合α干擾素集中了各種天然干擾素的優(yōu)點,具有更強、更廣譜的抗病毒作用,體外生物活性實驗證明,cIFN的生物活性是其他兩種常用干擾素 (IFN-α2a、IFN-α2b) 的5~10倍[2]。畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種比較理想的真核微生物表達系統(tǒng),兼有原核細胞的可操縱性和真核細胞的翻譯后加工的雙重優(yōu)點,用其表達的重組蛋白更接近天然蛋白的構(gòu)象,是外源基因表達的理想宿主[3]。另外畢赤酵母自身分泌的蛋白 (背景蛋白) 非常少,能以很高的純度 (30%~80 %的胞外總蛋白) 表達分泌重組蛋白[4],這樣能簡化分離純化工藝,對工業(yè)化生產(chǎn)十分有利。

    甲醇既作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)畢赤酵母表達外源蛋白,還同時作為碳源為酵母生長提供能量,因此甲醇的控制對外源蛋白的表達影響很大。目前有關(guān)甲醇影響酵母表達的研究主要集中在如何控制酵母生長和增加外源蛋白表達量上,如混合碳源流加[5],控制比生長速率流加[6],控制一定甲醇濃度流加[7]等。畢赤酵母表達蛋白時也會有信號肽加工不完全、形成聚合體、蛋白降解等特征導(dǎo)致目的蛋白表達的不均一性[8],造成目的蛋白的減少及后期分離純化的困難。已有研究表明畢赤酵母表達重組人復(fù)合 α干擾素中pH[9]、誘導(dǎo)溫度[10]等環(huán)境因素影響畢赤酵母胞外表達外源蛋白時發(fā)酵液中重組蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,但是甲醇濃度影響酵母表達外源蛋白的穩(wěn)定性鮮見報道。本課題組采用畢赤酵母工程菌在復(fù)合培養(yǎng)基中表達重組人復(fù)合α干擾素cIFN時,遇到不同的甲醇濃度下 cIFN的分離純化得率差別非常大的現(xiàn)象。本文對這種現(xiàn)象進行了分析,發(fā)現(xiàn)在不同甲醇濃度下 cIFN的存在狀態(tài)有很大的變化,較高甲醇濃度時大量的cIFN聚合會造成cIFN單體減少。本文著重分析了不同甲醇濃度和 cIFN穩(wěn)定性之間的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株

    畢赤酵母工程菌 Pichia pastoris GS115/ pPIC9-cIFN (R164S)。遺傳表型Mut+his+,啟動子為PAOX1,載體 pPIC9K,信號肽序列來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的α-MF,外源基因為編碼重組人復(fù)合α干擾素的基因,載體呈線型整合在染色體上,該菌種由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉志敏教授提供。

    1.1.2 主要試劑

    復(fù)合干擾素標品干復(fù)津購自美國Amgen公司,鼠抗人α干擾素單抗購自Abcam公司,羊抗鼠過氧辣根化酶購自華美生物工程公司,酵母提取物購自O(shè)xiod公司,胰蛋白胨購自日本制藥株式會社,酵母基本氮源 (YNB) 購自 Difco公司,疏水填料Phenyl-Sepharose FF、陰離子交換色譜填料 DEAE Sephadex A-25匍聚糖凝膠和離子交換色譜填料Sephacyal-HR200購自美國Amersham公司。其他化學(xué)試劑均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑公司。

    1.2 培養(yǎng)方法

    1.2.1 種子培養(yǎng)方法

    挑取YPG平板上的新鮮Pichia pastoris GS115/ pPIC9-cIFN (R164S) 單菌落,接入含有 50 mL BMGY種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD為6~8時,將50 mL種子培養(yǎng)液全部接入5 L發(fā)酵罐中 (含1.8 L的復(fù)合培養(yǎng)基見1.2.3)。

    1.2.2 5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

    甘油生長期和過渡期溫度控制30 ℃,pH為5.4,通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速200~900 r/min之間來維持溶解氧(DO) 在 30%以上。當(dāng)基礎(chǔ)料中的甘油耗盡后,此時DO急劇上升,開始流加濃度為50%甘油,并以維持DO在40%為依據(jù)控制甘油補料速率,當(dāng)細胞干重 (DCW) 到達30后停止補甘油。進入甲醇誘導(dǎo)期后,以在線甲醇電極 (華東理工大學(xué),中國上海)監(jiān)控發(fā)酵液中的甲醇殘留濃度來控制甲醇流加速率,分別以 0.25%、0.5%、0.75%三個甲醇濃度進行研究。誘導(dǎo)期間維持DO>20%,當(dāng)溶氧過低時通入富氧空氣。通過氨水和酵母生長自身產(chǎn)酸控制甲醇誘導(dǎo)期的pH,誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

    1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

    復(fù)合培養(yǎng)基:酵母提取物 10 g/L,蛋白胨20 g/L,YNB 13.4 g/L,甘油28 g/L,消泡劑 289 0.2 g/L溶入0.1 mol/L (pH 6.0) 的磷酸緩沖液中。添加 1 mmol/L PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) 的絲氨酸蛋白酶抑制劑。

    補料:50%的甘油,100%甲醇,分別加入PTM112 mL于每升補料溶液中。

    1.3 分析方法

    1.3.1 cIFN的分離純化

    先用 30%飽和度硫酸銨沉淀發(fā)酵液上清中的cIFN,沉淀離心后重新溶于 0.8 mol/L的硫酸銨(pH 8.3) 上樣 Phenyl-Sepharose FF疏水柱,用0.5 mol/L 硫酸銨洗脫后透析,樣品濃縮后上樣DEAE Sephadex A-25陰離子交換柱,采用0.3 mol/L NaCl洗脫,收集含目的蛋白洗脫峰,濃縮后采用 Sephacyal-HR200分子篩柱層析進行最后脫鹽純化。

    1.3.2 菌體濃度

    取1 mL發(fā)酵液,12 000 r/min離心10 min,去上清液,用0.1 mol/L稀鹽酸洗滌2次,離心后吸干表面水分稱其濕重,80 ℃烘干至恒重稱其干重。

    1.3.3 目的蛋白cIFN濃度測定

    將蛋白還原電泳結(jié)果經(jīng)掃描輸入計算機,以干復(fù)津為標準品,采用TotalLab v1.11凝膠圖像處理軟件分析,根據(jù)還原電泳條帶染色強度進行定量分析。

    1.3.4 蛋白電泳

    凝膠配方和電泳操作過程參照《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》[11]方法進行。還原電泳濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為15%;天然電泳濃縮膠濃度為3%,分離膠濃度為6%,考馬斯亮藍染色。

    1.3.5 cIFN免疫印跡 (Western blotting)

    電泳后的凝膠不進行染色,直接將上面的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上,先用50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩沖液洗滌,再用5%的脫脂奶粉 (PBST稀釋,PBST:0.01 mol/L PBS+0.05% Tween,pH 7.5) 作為封閉液封閉,再用含有1∶1 000的鼠抗人α干擾素單抗室溫反應(yīng)2 h,洗滌后用含有1∶500羊抗鼠過氧辣根化酶室溫反應(yīng)2 h,洗滌后最后用新鮮制備的底物二氨基聯(lián)苯胺溶液 (DAB溶液) 顯色5 min,用去離子水沖洗終止顯色反應(yīng)。

    1.3.6 生物活性測定

    生物活性測定:采用細胞病變抑制法[12],采用WISH細胞/VSV系統(tǒng)測定。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度甲醇誘導(dǎo)下細胞生長和表達情況分析

    采用補料分批發(fā)酵控制策略,當(dāng)細胞干重(DCW) 到達 30左右開始進入甲醇誘導(dǎo)期。用甲醇電極維持發(fā)酵液中甲醇濃度在 0.25%、0.5%和0.75%三個值來控制甲醇的流加。由于甲醇用來誘導(dǎo)和同時提供碳源,因此甲醇濃度越高細胞生長越快 (圖1A)。酵母對cIFN的表達量也顯示出類似的趨勢,甲醇的濃度越高,表達水平越高,誘導(dǎo)66 h后0.25%、0.5%和0.75%甲醇濃度對應(yīng)的cIFN表達水平分別為1.66、1.87和2.06 g/L。圖1可以看出利用畢赤酵母高效表達 cIFN時重組蛋白的分泌同細胞的生長緊密相連,細胞生長則cIFN含量增加,細胞停止生長時cIFN含量也保持不變,這在甲醇濃度為 0.75%時表現(xiàn)尤為明顯。當(dāng)然甲醇濃度也并非越高越好,超過一定濃度反而對細胞造成毒害作用。在本研究中,如果單從表達量來看,0.75%甲醇濃度似乎是表達cIFN的最佳甲醇濃度。

    2.2 不同濃度甲醇誘導(dǎo)下cIFN分離純化分析

    畢赤酵母分泌性表達外源蛋白的優(yōu)勢之一就是其自身內(nèi)源性蛋白很少分泌到發(fā)酵液中,這非常有利于后期重組蛋白的分離純化工作。然而在本研究中很奇怪的是,誘導(dǎo)66 h后在0.75%高甲醇濃度下雖然cIFN表達量最高,但是其分離純化的得率卻非常低,反之,雖然0.25%的低甲醇濃度下cIFN表達量有所下降,但是其得率很高,最終獲得的cIFN純品反而要大大高于0.75%的甲醇濃度所誘導(dǎo) (表1)。分析表 1數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在高甲醇濃度下,疏水層析這一步損失很大,得率只有 25.2%,相比之下低甲醇濃度的這一步得率則達到 87.5%。只有在高甲醇濃度誘導(dǎo)下發(fā)酵液中 cIFN的性質(zhì)改變才可能導(dǎo)致這種較大的純化損失。為了進一步驗證這種可能性,我們又繼續(xù)分析了各自發(fā)酵液的cIFN生物活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高甲醇濃度誘導(dǎo)下發(fā)酵液中 cIFN比活僅為低甲醇濃度下的七分之一 (表 2)。這些研究結(jié)果顯示,雖然在0.75%甲醇濃度下cIFN表達量最高,但是其發(fā)酵液比活最低,有可能在高甲醇濃度下cIFN不是以單體狀態(tài)存在,考慮到前人發(fā)現(xiàn)在較高溫度下誘導(dǎo)容易產(chǎn)生cIFN聚合體[10],我們推測在高甲醇濃度條件下發(fā)酵液中 cIFN也可能大部分以聚合體形式存在。

    2.3 不同濃度甲醇誘導(dǎo)下cIFN穩(wěn)定性分析

    2.3.1 共價聚合情況分析

    從圖2非還原和還原SDS-PAGE電泳免疫印跡比較,在非還原條件下泳道 1~3均可以看到 cIFN聚合體,只是各自的聚合程度有很大差別。代表0.75%高甲醇濃度誘導(dǎo)的泳道1有低聚體、三聚體、二聚體和單體,代表0.5%甲醇濃度誘導(dǎo)的泳道2可以看出明顯的二聚體和三聚體,而代表 0.25%低甲醇濃度誘導(dǎo)的泳道 3中只能看到微量的二聚體。由此可見,不同誘導(dǎo)甲醇濃度對cIFN的穩(wěn)定性有很大影響,高甲醇濃度下cIFN不穩(wěn)定,容易形成各種聚aAmmonium sulfate precipitation;bPhenyl-Sepharose FF chromatography;cDEAE Sephadex A-25 chromatography;dSephacyal-HR200 chromatography;ePurified cIFN per liter supernatant.合體,而低甲醇濃度下cIFN穩(wěn)定性明顯要好。將同樣的樣品進行還原SDS-PAGE電泳分析,從泳道4~6可以看出經(jīng)過還原電泳后所有在非還原狀態(tài)下存在的聚合體均消失。非還原電泳只能打開由疏水作用、氫鍵、靜電作用、范德華力等非共價鍵結(jié)合的作用力,而還原電泳還可以打開非還原電泳不能打開的二硫鍵,說明非還原電泳圖上顯示的各種聚合體是通過二硫鍵結(jié)合的。cIFN單體含有2對分子內(nèi)二硫鍵,在還原電泳中由于二硫鍵破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處于松散狀態(tài),影響其電泳泳動速率,所以其表觀分子量要大于非還原電泳,導(dǎo)致對應(yīng)的Western blotting上的單體位置有微小差別。

    圖1 不同誘導(dǎo)甲醇濃度下細胞生長 (A) 和cIFN表達量 (B) 分析Fig. 1 Effect of different methanol concentrations on cell growth (A) and cIFN expression level (B). Error bars stand for standard deviation (SD).

    表1 不同誘導(dǎo)甲醇濃度下發(fā)酵液cIFN分離純化分析Table 1 Effect of different methanol concentrations on the purification yield rate of cIFN

    表2 不同濃度甲醇誘導(dǎo)下發(fā)酵液cIFN活性分析Table 2 Effect of different methanol concentrations on cIFN bioactivity ± s)

    表2 不同濃度甲醇誘導(dǎo)下發(fā)酵液cIFN活性分析Table 2 Effect of different methanol concentrations on cIFN bioactivity ± s)

    Methanol concentration (W/V) cIFN bioactivity (108 IU/mL) cIFN specific bioactivity (108 IU/g protein) 0.75 0.52±0.07 0.24±0.03 0.50 1.57±0.13 0.84±0.081 0.25 2.85±0.25 1.72±0.15

    圖2 不同濃度甲醇誘導(dǎo)下上清液非還原和還原SDS- PAGE免疫印跡Fig. 2 Western blotting of non-reducing and reducing SDS-PAGE under different methanol concentrations. 1, 4: 0.75%; 2, 5: 0.5%; 3, 6: 0.25%.

    另外一個還值得引起注意的現(xiàn)象是,在圖2泳道1中發(fā)現(xiàn)明顯的cIFN雙帶,泳道2中較為明顯,泳道3中基本上不明顯,與此對應(yīng)的,泳道1二硫鍵共價聚合最嚴重,泳道2次之,泳道3基本無聚合;經(jīng)過還原電泳后泳道1和2中的cIFN (分別對應(yīng)泳道3和4) 雙帶完全成為一條帶,說明cIFN雙帶很可能是二硫鍵結(jié)構(gòu)不完整的cIFN造成的,正是這種不完整 cIFN的存在導(dǎo)致了發(fā)酵液中共價鍵聚合體的產(chǎn)生。

    另外,為了區(qū)別是否是甲醇濃度變化影響cIFN二硫鍵結(jié)構(gòu)從而造成其共價聚合體,我們對含標準cIFN單體 (1 g/L) 的0.25%,0.5%和0.75%濃度甲醇溶液進行攪拌過夜,再用非還原SDS-PAGE分析其聚合體的產(chǎn)生情況。從圖3可以看出,加入cIFN到不同甲醇濃度溶液后攪拌均勻馬上取樣 (泳道1~3) 和攪拌過夜后再取樣 (泳道 4~6) 的非還原電泳圖上沒有看到任何聚合體條帶,同圖 2非還原SDS-PAGE圖中cIFN聚合體形成明顯對比。此結(jié)果清晰地顯示甲醇濃度變化不會引起 cIFN結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而也無法形成各種cIFN聚合體。

    2.3.2 非共價聚合情況分析

    在 Native-PAGE免疫印跡中,0.75%高甲醇濃度誘導(dǎo)下的發(fā)酵液樣品中的 cIFN單體呈現(xiàn)出微弱的條帶 (圖4,泳道1),在0.5%甲醇濃度cIFN單體條帶加深 (圖4,泳道2),而在0.25%甲醇情況下電泳顯示出較濃的cIFN單體條帶 (圖4,泳道3)。不同的是,cIFN單體上方的聚合體拖尾條帶呈現(xiàn)出相反的狀況,在高甲醇濃度誘導(dǎo)下出現(xiàn)明顯的聚合體 (圖4,泳道1)。Tween-80是一種非離子表面活性劑,可以打開蛋白質(zhì)非共價聚合體而轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w[13]。為了證明這些聚合體是非共價聚合體,在發(fā)酵液中加入Tween-80后再進行同樣電泳 (圖4,泳道4~6),結(jié)果顯示所有樣品的拖尾程度均明顯變輕,而泳道中的cIFN單體的濃度則明顯增加,說明發(fā)酵液上清中存在有非共價聚合體。對圖4泳道1和4樣品的cIFN生物活性測定也顯示,加入 Tween-80后可以使發(fā)酵液活性提高了63%,進一步說明加入Tween后cIFN非共價聚被打開而使單體含量提高。

    圖3 不同濃度甲醇溶液中cIFN穩(wěn)定性非還原SDS-PAGE分析.Fig. 3 Western blotting of non-reducing SDS-PAGE at different methanol concentration solutions. 1, 4: 0.75%; 2, 5: 0.5%; 3, 6: 0.25%. 1?3: samples taked at time of cIFN adding into methanol solution; 4?6: samples taked after 12 h at time of adding into methanol solution.

    圖4 Tween-80處理前后 3種甲醇濃度誘導(dǎo)下發(fā)酵液上清Native-PAGE免疫印跡Fig. 4 Native-PAGE of supernatant treated without Tween-80 (?) and with Tween-80 (+) under three different methanol concentrations. 1, 4: 0.75%; 2, 5: 0.5%; 3, 6: 0.25%.

    3 討論

    雖然畢赤酵母現(xiàn)在越來越廣泛用于表達各種外源蛋白,但是重組蛋白質(zhì)尤其是具有復(fù)雜二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在發(fā)酵液中不穩(wěn)定的現(xiàn)象一直是個難題[14-15]。甲醇濃度是畢赤酵母發(fā)酵調(diào)控中的一個很重要的參數(shù),研究都集中在如何優(yōu)化甲醇濃度來提高重組蛋白的產(chǎn)量,卻忽視了它影響重組蛋白的穩(wěn)定性的可能。本研究首次發(fā)現(xiàn)高甲醇濃度誘導(dǎo)雖然可以提高重組蛋白質(zhì)的表達量,但是卻容易導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的聚合,雖然表達量很高,但是分離純化的得率卻很低,最終極大地降低了生產(chǎn)效率。本文提示今后在進行畢赤酵母發(fā)酵放大過程中,需要轉(zhuǎn)變優(yōu)化甲醇濃度僅僅為提高表達量的思路,還應(yīng)該將甲醇濃度可能會影響重組蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性納入發(fā)酵優(yōu)化考慮的范圍。

    二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)起非常重要的作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子內(nèi)二硫鍵打開時,游離的-SH基團會在蛋白質(zhì)分子間形成二硫鍵,這樣就形成了各種二硫鍵共價聚合體。由于蛋白質(zhì)大部分疏水基團埋在分子內(nèi)部,二硫鍵的破壞也會使分子內(nèi)疏水基團暴露出來,這樣也容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間形成疏水性的非共價聚合體[16]。本研究中cIFN形成共價聚合和疏水聚合也正是蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵遭到破壞的結(jié)果。但關(guān)鍵的問題是,cIFN中二硫鍵是如何遭到破壞的?一般認為發(fā)酵過程中長時間的高速攪拌和氣液介面等物理條件作用會破壞蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致聚合體產(chǎn)生[17]。本研究中,首先排除了由于甲醇濃度變化引起的cIFN二硫鍵結(jié)構(gòu)變化。進一步分析在 0.25%低甲醇濃度誘導(dǎo)發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)速及通氣量和 0.75%的高誘導(dǎo)甲醇濃度相似,但是在低甲醇濃度下卻可以有效避免聚合體的產(chǎn)生,說明cINF的聚合同攪拌等外界因素沒有直接關(guān)系,這為今后研究畢赤酵母發(fā)酵過程中重組蛋白質(zhì)聚合體的來源提供了一個全新的視角。由于甲醇既是細胞利用的碳源又是誘導(dǎo)劑,所以甲醇濃度的變化很容易使細胞的生理發(fā)生改變。Mayson等發(fā)現(xiàn)在1%甲醇濃度下細胞生長迅速,但是最佳的表達量卻是在0.7%甲醇時獲得的[18]。我們推測,高甲醇濃度下細胞生長明顯要快于低甲醇濃度,這樣必然會占用大量的細胞伴侶蛋白如Bip和PDI等以優(yōu)先合成高速生長下自身需要的各種內(nèi)源性蛋白[19],如果此時外源蛋白再大量表達,很有可能折疊不完全或者只生成部分二硫鍵,而這種錯誤折疊的蛋白質(zhì)分泌到胞外后會對重組蛋白的穩(wěn)定性造成影響,該推論還需要進一步實驗來證實。

    本文通過還原和非還原SDS-PAGE已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中有含不完整二硫鍵的cIFN存在,接下來要做的工作是需要確定這些不完整的 cIFN中遭到破壞的是一對二硫鍵還是兩對全部都被破壞,因為二硫鍵的破壞程度不同對其穩(wěn)定性的影響也不同。另外又是何種因素導(dǎo)致了這些二硫鍵不完整的 cIFN的產(chǎn)生?這些研究將能進一步揭示畢赤酵母發(fā)酵過程中重組蛋白不穩(wěn)定的根源,為畢赤酵母發(fā)酵調(diào)控提供新的理論依據(jù)。

    REFERENCES

    [1] Alton K, Stabinsky Y, Richards R, et al. Production, characterization and biological effects of recombinant DNA derived human IFN-α and IFN-β analogs//De Maeyer E, Schellekens H, eds. The Biology of the Interferon System. Amsterdam: Elsevier, 1983: 119?128.

    [2] Blatt LM, Davis JM, Klein SB, et al. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species, consensus interferon. J Interferon Cytokine Res, 1996, 16(7): 489?499.

    [3] Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, et al. Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol, 2009, 463: 169?189.

    [4] Wan N, Hoppe HI, Goodrick JC, et al. Expression system for recombinant proteins: EP 1409695A2. 2004-04-21.

    [5] Jungo C, Schenk J, Pasquier M, et al. A quantitative analysis of the benefits of mixed feeds of sorbitol and methanol for the production of recombinant avidin with Pichia pastoris. J Biotechnol, 2007, 131(1): 57?66.

    [6] Zhang WH, Bevins MA, et al, Plantz BA. Modeling Pichia pastoris growth on methanol and optimizing the production of a recombinant protein, the heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin, serotype A. Biotechnol Bioeng, 2000, 70(1): 1?8.

    [7] Schenk J, Marison IW, von Stockar U. A simple method to monitor and control methanol feeding of Pichia pastoris fermentations using mid-IR spectroscopy. J Biotechnol, 2007, 128(2): 344?353.

    [8] Wang HH, Gao BY, Chen PL, et al. The analysis and countermeasure of heterogeneity of cIFN expressed in yeast. Sci China: Seri B, 1994, 24(12): 1270?1274.王洪海, 高卜渝, 陳佩麗, 等. 酵母表達基因工程產(chǎn)物不均一性分析及其對策. 中國科學(xué) B輯, 1994, 24(12): 1270?1274.

    [9] Zhang S, Hao YY, Chu J, et al. Effect of pH on proteolytic degradation of consensus interferon-α expressed by Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2008, 24(1): 164?168.張盛, 郝玉有, 儲炬, 等. pH對畢赤酵母表達重組人復(fù)合 α干擾素的降解影響. 生物工程學(xué)報, 2008, 24(1): 164?168.

    [10] Shi QQ, Hao YY, Wu KH, et al. The effect of induction temperature on aggregation of consensus interferon-α expressed by Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2006, 22(2): 311?315.史淇淇, 郝玉有, 吳康華, 等. 誘導(dǎo)相溫度對畢赤酵母表達重組人復(fù)合 α干擾素聚合的影響. 生物工程學(xué)報, 2006, 22(2): 311?315.

    [11] Guo RJ. The Laboratory Technology of Protein Electro-Phoresis. Beijing: Science Press, 1999.郭堯君. 蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù). 北京: 科學(xué)出版社, 1999.

    [12] Chinese Biologic Product Standardization Committee Compiled. Chinese Biological Product Regulations. Beijing: Chemical Industry Press, 2000.中國生物制品標準化委員會編. 中國生物制品規(guī)程. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000.

    [13] Wang W, Wang YJ, Wang DQ. Dual effects of Tween 80 on protein stability. Int J Pharmaceut, 2008, 347(1/2): 31?38.

    [14] Wu D, Hao YY, Chu J, et al. Inhibition of degradation and aggregation of recombinant human consensus interferon-amutant expressed in Pichia pastoris with complex medium in bioreactor. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80: 1063?1071.

    [15] Hao YY, Chu J, Wang YH, et al. Expressionand aggregation of recombinant human consensus interferon-α mutant by Pichia pastoris. Biotechnol Lett, 2006, 28(12): 905?909.

    [16] Bhattacharyya R, Pal D, Chakrabarti P. Disulfide bonds, their stereospecific environment and conservation inprotein structures. Protein Eng Des Sel, 2004, 17(11): 795?808.

    [17] Woo JH, Liu YY, Neville DM Jr. Minimization of aggregation of secreted bivalent anti-human T cell immunotoxin in Pichia pastoris bioreactor culture by optimizing culture conditions for protein secretion. J Biotechnol, 2006, 121: 75?85.

    [18] Mayson BE, Kilburn DG, Zamost BL, et al. Effects of methanol concentration on expression levels of recombinant protein in fed-batch cultures of Pichia methanolica. Biotechnol Bioeng, 2003, 81(3): 291?298.

    [19] Xu P, Raden D, Doyle FJ III, et al. Analysis of unfolded protein response during single-chain antibody expression in Saccaromyces cerevisiae reveals different roles for BiP and PDI in folding. Metab Eng, 2005, 7(4): 269?279.

    猜你喜歡
    二硫鍵泳道電泳
    得分一瞬
    睿士(2023年9期)2023-09-20 05:47:07
    二硫鍵影響GH11木聚糖酶穩(wěn)定性研究進展
    基于質(zhì)譜技術(shù)的二硫鍵定位分析方法研究進展
    液相色譜質(zhì)譜對重組人生長激素-Fc(CHO 細胞)二硫鍵連接的確認
    輔助陽極在輕微型廂式車身電泳涂裝中的應(yīng)用
    家蠶色氨酸羥化酶 (TRH) 基因的克隆及表達特性分析
    PPG第四屆電泳涂料研討會在長沙成功舉辦
    上海建材(2017年4期)2017-04-06 07:32:03
    二硫鍵在蛋白質(zhì)中的作用及其氧化改性研究進展
    中國飼料(2016年17期)2016-12-01 08:08:19
    改良的Tricine-SDS-PAGE電泳檢測胸腺肽分子量
    游泳池里的航母
    伊人久久国产一区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 一级毛片电影观看| 成人黄色视频免费在线看| 黄色配什么色好看| 日韩视频在线欧美| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品自拍成人| 国产伦理片在线播放av一区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产视频首页在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲,一卡二卡三卡| 极品人妻少妇av视频| 精品熟女少妇av免费看| 另类亚洲欧美激情| 久久久久久久国产电影| 美女内射精品一级片tv| 精品久久久久久电影网| 在线看a的网站| 亚洲三级黄色毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 99香蕉大伊视频| 国产精品一区二区在线观看99| 久久亚洲国产成人精品v| 男人添女人高潮全过程视频| 免费少妇av软件| 国产乱来视频区| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲综合色网址| 欧美xxⅹ黑人| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇 在线观看| 婷婷色综合www| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 女人久久www免费人成看片| 午夜福利视频在线观看免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| av片东京热男人的天堂| 久久国产精品大桥未久av| 日韩电影二区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 综合色丁香网| av片东京热男人的天堂| 欧美xxⅹ黑人| 国产毛片在线视频| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产一区二区在线观看av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 18+在线观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 99久久精品国产国产毛片| xxx大片免费视频| 超色免费av| 国产高清不卡午夜福利| 成年动漫av网址| 自线自在国产av| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品 国内视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男人舔女人的私密视频| av不卡在线播放| 国产综合精华液| av又黄又爽大尺度在线免费看| 交换朋友夫妻互换小说| 蜜桃在线观看..| 伊人久久国产一区二区| 久久精品夜色国产| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲av福利一区| 亚洲精品,欧美精品| 在线精品无人区一区二区三| 国产深夜福利视频在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 多毛熟女@视频| 日韩中字成人| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一个人免费看片子| 秋霞在线观看毛片| 午夜老司机福利剧场| 亚洲欧洲日产国产| 免费高清在线观看日韩| 日日啪夜夜爽| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 日韩三级伦理在线观看| 欧美另类一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 满18在线观看网站| 色94色欧美一区二区| 99re6热这里在线精品视频| 两个人免费观看高清视频| av线在线观看网站| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品99久久99久久久不卡 | 夜夜爽夜夜爽视频| 久久精品夜色国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| av国产精品久久久久影院| 久久综合国产亚洲精品| 一级片'在线观看视频| 日本wwww免费看| 成人手机av| 婷婷色麻豆天堂久久| 满18在线观看网站| 最近中文字幕2019免费版| 午夜福利网站1000一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费看光身美女| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品一品国产午夜福利视频| 涩涩av久久男人的天堂| 高清毛片免费看| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产一区二区三区综合在线观看 | 大香蕉97超碰在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 熟女av电影| 熟女电影av网| 国产精品 国内视频| 国产精品三级大全| 国产精品熟女久久久久浪| 一二三四在线观看免费中文在 | 我要看黄色一级片免费的| 亚洲国产最新在线播放| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品蜜桃在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 国产av精品麻豆| 亚洲天堂av无毛| 久久ye,这里只有精品| www日本在线高清视频| 最近手机中文字幕大全| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久人人爽人人片av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| videosex国产| 日本91视频免费播放| 十八禁高潮呻吟视频| 国产深夜福利视频在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 边亲边吃奶的免费视频| 久久久国产一区二区| 午夜av观看不卡| 天堂中文最新版在线下载| 国产在线视频一区二区| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久热这里只有精品99| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 99久久人妻综合| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产精品久久久久久精品古装| 国产成人欧美| 欧美亚洲日本最大视频资源| 妹子高潮喷水视频| 国产又爽黄色视频| 国产成人精品一,二区| 午夜影院在线不卡| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产又爽黄色视频| 午夜影院在线不卡| 男女午夜视频在线观看 | 高清视频免费观看一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 色哟哟·www| 亚洲成人av在线免费| 晚上一个人看的免费电影| 久久午夜综合久久蜜桃| 丝袜人妻中文字幕| 久久久欧美国产精品| 一本大道久久a久久精品| 最新中文字幕久久久久| 国产精品.久久久| 18禁动态无遮挡网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产熟女午夜一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 成人二区视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 看非洲黑人一级黄片| 最近中文字幕2019免费版| 免费人成在线观看视频色| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品久久精品一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲高清免费不卡视频| 午夜91福利影院| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美精品亚洲一区二区| 国产又爽黄色视频| 不卡视频在线观看欧美| 在线天堂最新版资源| 香蕉丝袜av| 成人毛片60女人毛片免费| 制服丝袜香蕉在线| av在线观看视频网站免费| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲国产av新网站| 国产成人精品婷婷| 久久ye,这里只有精品| 欧美性感艳星| 久久99热这里只频精品6学生| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品久久久精品久久久| 最后的刺客免费高清国语| 下体分泌物呈黄色| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美丝袜亚洲另类| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品一二三| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成色77777| av.在线天堂| 精品人妻偷拍中文字幕| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品一国产av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| av免费在线看不卡| 七月丁香在线播放| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品三级大全| 亚洲精品久久午夜乱码| 大片免费播放器 马上看| 午夜福利影视在线免费观看| 老司机亚洲免费影院| 亚洲五月色婷婷综合| 美女视频免费永久观看网站| 中文字幕免费在线视频6| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品人妻久久久久久| 九草在线视频观看| 国产熟女欧美一区二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 最黄视频免费看| 久久这里只有精品19| 亚洲av福利一区| 国产精品一区二区在线不卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产成人精品婷婷| 亚洲精品,欧美精品| videosex国产| 精品视频人人做人人爽| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av国产精品久久久久影院| 午夜激情久久久久久久| 日韩伦理黄色片| 伊人亚洲综合成人网| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇的逼水好多| 欧美成人午夜免费资源| 国产高清三级在线| 色5月婷婷丁香| 大陆偷拍与自拍| av在线观看视频网站免费| 日韩精品有码人妻一区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一级毛片 在线播放| 免费大片18禁| 最后的刺客免费高清国语| 免费看av在线观看网站| 国产免费又黄又爽又色| 免费在线观看完整版高清| 国产免费现黄频在线看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人av激情在线播放| 日本欧美国产在线视频| 欧美丝袜亚洲另类| 在线观看一区二区三区激情| 国产成人一区二区在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜激情久久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久精品性色| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产av一区二区精品久久| 最近中文字幕2019免费版| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲内射少妇av| 久久午夜福利片| 亚洲成人一二三区av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品 国内视频| 日本vs欧美在线观看视频| 国产综合精华液| 久久久久精品性色| av在线app专区| 捣出白浆h1v1| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 九色亚洲精品在线播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产探花极品一区二区| 午夜日本视频在线| 国产男人的电影天堂91| 9191精品国产免费久久| 黄色 视频免费看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费观看在线日韩| 又大又黄又爽视频免费| www.熟女人妻精品国产 | 91精品三级在线观看| 街头女战士在线观看网站| 久久久国产一区二区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 18禁动态无遮挡网站| 美女中出高潮动态图| 亚洲成色77777| 午夜av观看不卡| 男女国产视频网站| 高清欧美精品videossex| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产精品人妻久久久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费| 免费在线观看黄色视频的| 中国国产av一级| a 毛片基地| 精品亚洲成国产av| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品 国内视频| 成人国语在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲精品456在线播放app| 秋霞伦理黄片| 欧美日韩综合久久久久久| 美女主播在线视频| 九色成人免费人妻av| 丝袜美足系列| 高清毛片免费看| www.av在线官网国产| 免费观看a级毛片全部| 青春草亚洲视频在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av电影在线进入| 久久精品国产自在天天线| 成人影院久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产免费又黄又爽又色| 欧美3d第一页| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品视频女| 亚洲一区二区三区欧美精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男人舔女人的私密视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产精品久久久久久精品古装| a级片在线免费高清观看视频| av网站免费在线观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 大香蕉97超碰在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费av不卡在线播放| 一级毛片 在线播放| videossex国产| av黄色大香蕉| 日本黄大片高清| 各种免费的搞黄视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 另类精品久久| 国产成人一区二区在线| 波多野结衣一区麻豆| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 秋霞在线观看毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 午夜日本视频在线| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲国产精品成人久久小说| av线在线观看网站| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 人妻人人澡人人爽人人| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产成人精品无人区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩一区二区三区影片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 26uuu在线亚洲综合色| 咕卡用的链子| 精品亚洲成国产av| 精品人妻偷拍中文字幕| 人人澡人人妻人| 晚上一个人看的免费电影| 久久久国产精品麻豆| 精品一区二区免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 丁香六月天网| 母亲3免费完整高清在线观看 | 满18在线观看网站| 亚洲欧洲日产国产| 免费看av在线观看网站| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 涩涩av久久男人的天堂| 国产成人精品久久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 欧美日韩av久久| 99re6热这里在线精品视频| 国产一区二区在线观看av| 春色校园在线视频观看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 亚洲欧洲日产国产| 久久久精品区二区三区| 国产在线免费精品| 成人国语在线视频| 丝袜脚勾引网站| 亚洲久久久国产精品| 桃花免费在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日本欧美国产在线视频| 97超碰精品成人国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品少妇久久久久久888优播| 涩涩av久久男人的天堂| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 草草在线视频免费看| 国精品久久久久久国模美| 高清毛片免费看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 99久国产av精品国产电影| 国产不卡av网站在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国内精品宾馆在线| 亚洲,欧美精品.| 人人妻人人澡人人看| 老司机影院成人| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲美女黄色视频免费看| 丝袜美足系列| 精品人妻在线不人妻| 99热国产这里只有精品6| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 少妇的逼水好多| 免费在线观看黄色视频的| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久久久久久久成人| 日韩大片免费观看网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久精品94久久精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av日韩在线播放| 看免费av毛片| 成年动漫av网址| 少妇人妻 视频| 97人妻天天添夜夜摸| 国产一区二区激情短视频 | tube8黄色片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品一区www在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产视频首页在线观看| 亚洲伊人色综图| 国产黄色免费在线视频| 热re99久久国产66热| 赤兔流量卡办理| 草草在线视频免费看| 欧美成人午夜精品| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久久久精品精品| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 欧美另类一区| 高清毛片免费看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品少妇内射三级| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产一区二区在线观看av| 两性夫妻黄色片 | 三级国产精品片| 亚洲人成77777在线视频| 夫妻午夜视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av在线观看视频网站免费| 久久韩国三级中文字幕| 久久久精品免费免费高清| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 婷婷成人精品国产| 中文天堂在线官网| av国产精品久久久久影院| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日本与韩国留学比较| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久久久久久免费av| 男女国产视频网站| 免费黄频网站在线观看国产| 日本午夜av视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 寂寞人妻少妇视频99o| 黑人欧美特级aaaaaa片| 天天影视国产精品| 又大又黄又爽视频免费| 麻豆乱淫一区二区| 国产av码专区亚洲av| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜福利乱码中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av片东京热男人的天堂| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 男男h啪啪无遮挡| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 午夜视频国产福利| 一级毛片 在线播放| 如何舔出高潮| 亚洲一区二区三区欧美精品| 99久久精品国产国产毛片| 国产有黄有色有爽视频| 春色校园在线视频观看| av有码第一页| 黄色毛片三级朝国网站| 国产精品不卡视频一区二区| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇熟女欧美另类| 边亲边吃奶的免费视频| 性色avwww在线观看| videosex国产| 精品少妇久久久久久888优播| 蜜桃在线观看..| 亚洲欧洲日产国产| 一级爰片在线观看| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产精品无大码| 免费黄色在线免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲经典国产精华液单| 免费观看无遮挡的男女| 国产在线视频一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产又色又爽无遮挡免| 国产激情久久老熟女| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| av黄色大香蕉| 视频区图区小说| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美日韩综合久久久久久| 国产1区2区3区精品| 久久久久国产网址| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产毛片在线视频| 久久影院123| 蜜桃在线观看..| 欧美精品av麻豆av| 久久婷婷青草| 多毛熟女@视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日韩av免费高清视频| 一级爰片在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品亚洲成国产av| 亚洲成国产人片在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久国产欧美日韩av| 色吧在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 成人国产av品久久久| 亚洲精品国产av成人精品| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲,一卡二卡三卡| www.av在线官网国产| 国产1区2区3区精品| 五月开心婷婷网| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色一级大片看看| 91精品国产国语对白视频| 国产免费现黄频在线看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品熟女久久久久浪| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区|