高效液相色譜法測定冬蟲夏草口服液中腺苷

許 勇， 王 柯， 季 申

(上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203)

冬蟲夏草口服液其處方由冬蟲夏草單方組成，具有補(bǔ)腎益肺、秘精益氣等功能。其主要活性成分之一腺苷是一種內(nèi)源性嘌呤核苷，具有舒張血管、降低血壓、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌、鎮(zhèn)靜和抗驚厥等多種生理活性［1］。為控制藥品質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，我們建立了用高效液相色譜法對制劑中冬蟲夏草的活性成分腺苷進(jìn)行了測定。冬蟲夏草及其制劑中腺苷的測定方法文獻(xiàn)報(bào)道的主要為高效液相色譜法［2-4］。如其中冬蟲夏草藥材中腺苷的主要提取方法為用有機(jī)試劑超聲或回流提取后蒸干，溶劑定容后，利用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析。而冬蟲夏草口服液文獻(xiàn)報(bào)道的提取方法為用水、乙醚、水飽和的正丁醇依次萃取，正丁醇液蒸干，溶劑定容后，利用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析。方法均較為繁瑣、費(fèi)時(shí)。而筆者是利用了口服液制劑中易干擾測定的多糖量較高，而多糖在被醇沉后，高速離心下容易沉淀的特點(diǎn)，建立了醇沉后離心的簡單易行的前處理方法，該方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可有效地控制本品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器(美國Agilent公司);Sartorius BS2202/CP225D型電子天平(德國Sartorius公司);腺苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號879-200001);冬蟲夏草口服液(中華御醫(yī)堂養(yǎng)生文化研究院有限公司與上海御醫(yī)堂保健科技有限公司提供，批號 20080117、20080114、20080226);甲醇、乙腈均為色譜純(MERCK公司)，試劑均為分析純［中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司］。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

取腺苷對照品溶液在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描，由光譜圖可見，腺苷對照品在260 nm波長處有最大吸收，故選擇260 nm作為檢測波長。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱 Thermo ODS-HYPERSIL(0.46 cm ×20 cm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相甲醇－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測波長:260 nm;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按腺苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液的制備 取腺苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇3 mL，搖勻，放冷后，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.3.3 陰性對照溶液的制備 取缺冬蟲夏草的樣品按制備工藝制備冬蟲夏草口服液，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.4 方法專屬性考察

按上述色譜條件分別對對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液進(jìn)行分析，結(jié)果無干擾。見圖1。

圖1 腺苷的高效液相色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取腺苷對照品適量，加50%甲醇制成濃度分別為0.362 5 mg/mL的對照品溶液⑴與濃度為36.25 μg/mL的對照品溶液⑵。分別精密吸取對照品溶液⑴2、5、10 μL 和對照品溶液⑵1、2、5、10 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，腺苷在0.036 25 ～3.625 μg范圍內(nèi)與峰面積值線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y=3 093X+22.74，r=0.999。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取36.25 μg/mL的腺苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，腺苷峰面積RSD值分別為0.11%，表明測定精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一冬蟲夏草口服液樣品(批號:20080117)，各一式6份，按2.3.2項(xiàng)下的方法分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。計(jì)算其RSD值為0.50%，表明測定重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液(批號:20080117)于室溫下放置 0、4、6、9、18、24 h，進(jìn)樣測定。計(jì)算得腺苷的峰面積的RSD值為1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 精密量取已知量的樣品(批號:20080117)2.5 mL，一式9份，置10 mL量瓶中，以3份為1組，分別精密加入腺苷對照品溶液適量，制備供試品溶液，按色譜條件項(xiàng)下測定，計(jì)算平均回收率為101.4%，(RSD=0.91%)。

2.5.6 樣品測定 取 3樣品，批號分別為 20080117、20080114、20080226，分別按 2.3.2 項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算質(zhì)量濃度，結(jié)果分別為55、56、56 μg/mL。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的考察

對①甲醇-水(15∶85);②乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(7∶93)和③甲醇－0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察。經(jīng)試驗(yàn)，流動(dòng)相系統(tǒng)①得到的對照品色譜圖中，色譜峰脫尾嚴(yán)重，對稱性較差;流動(dòng)相系統(tǒng)②得到的供試品色譜圖中，腺苷色譜峰雖然對稱性較好，但與其他色譜峰的分離度較差，沒有達(dá)到基線分離;流動(dòng)相系統(tǒng)③得到的供試品色譜圖中，腺苷色譜峰較對稱，且與其他色譜峰均分離良好，故選擇流動(dòng)相③用于檢測。

3.2 沉淀溶劑的選擇

冬蟲夏草口服液中含有大量的多糖，為了消除多糖對腺苷測定的影響，考慮用有機(jī)溶劑沉淀的方法。為有效對樣品進(jìn)行凈化，對沉淀溶劑進(jìn)行了考察，試驗(yàn)中曾經(jīng)選擇用乙醇和甲醇兩種有機(jī)試劑對糖進(jìn)行沉淀。精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，一式4份，以二份為一組，一組加甲醇稀釋至刻度，另一組加乙醇稀釋至刻度，分別搖勻，離心，取上清液進(jìn)樣分析，結(jié)果(見表1)表明，乙醇在沉淀糖與雜質(zhì)的時(shí)候，也將部分腺苷吸附下來，為保證凈化時(shí)不影響提取效率，最終選用甲醇作為沉淀溶劑。

表1 沉淀溶劑的考察

3.3 沉淀試劑加入量的選擇

為達(dá)到凈化效率最高且不影響提取效率，對凈化溶劑甲醇的加入量進(jìn)行了考察，分別對樣品與甲醇的比例為7∶3;1∶1;1∶4，3種比例進(jìn)行了考察。精密量取本品2、5、7 mL，分別置10mL量瓶中，一式兩份，分別加甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液進(jìn)樣分析，結(jié)果(見表2)表明，樣品與甲醇比例為1∶1時(shí)，能有效去除雜質(zhì)，且不影響腺苷被提出，故選擇精密量取樣品5 mL，加甲醇5 mL的凈化方法。

表2 甲醇加入量的考察

4 結(jié)論

冬蟲夏草藥材中腺苷的測定方法中國藥典2010年版一部也有收載［5］，本法與藥典的方法相比較，藥典是采用磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)［取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L 磷酸氫二鈉31.5 mL，混合(pH 6.5)］-甲醇(17∶3)作為流動(dòng)相系統(tǒng)，流動(dòng)相的配制方法較為繁瑣、費(fèi)時(shí)，而本法的流動(dòng)相是采用甲醇－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(15∶85)，配制方法較為簡便。且在前處理上，利用了口服液制劑多糖的特點(diǎn)，醇沉離心后直接進(jìn)樣，使方法更加簡單易行。

［1］方和桂，康 洪.HPLC測定金水寶膠囊中腺苷的含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25(3):243-244.

［2］黃紅兵，江英橋.蟲草口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，1999，21(5):228-230.

［3］張振謙，馬月飛，黃永春.蟲草腺苷含量的快速測定［J］.廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，18(3):4-7.

［4］夏文娟，曾曉英，袁海龍，等.不同產(chǎn)地冬蟲夏草腺苷含量測定［J］.中國中藥雜志，2001，26(8):540-542.

［5］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:106.