建立H5N1流感病毒感染雪貂動物模型

鮑琳琳，占玲俊，鄧 巍，許黎黎，朱 華，呂 琦，李楓棣，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

H5N1病毒從鳥直接傳到人的首次病例是於1997年在香港發(fā)現(xiàn)。迄今，絕大多數(shù)的人類感染病例都直接來自鳥，只有個別的病例被認(rèn)為是來自被感染的人，不過H5N1病毒尚未能在人與人之間建立持續(xù)的傳播鏈。根據(jù)禽流感致病性的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。由H5N1血清型引起的禽流感稱高致病性禽流感，發(fā)病率和死亡率都很高，危害巨大。高致病性禽流感病毒可以直接感染人類。1997年，在我國的香港地區(qū)，高致病性禽流感病毒H5N1型導(dǎo)致了18人感染，6人死亡，首次證實(shí)高致病性禽流感可以危及人的生命。

本研究選用人源 H5N1亞型禽流感病毒 A/ Vietnam/1203/2004對雪貂進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，以期建立人源流感病毒感染雪貂模型［4-8］，為探索禽流感病毒的病原特性、致病機(jī)制、藥物篩選及其疫苗評價(jià)提供研究平臺。同時，為進(jìn)一步防控禽流感在人間的暴發(fā)流行提供必要的實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 H5N1病毒株：A/Vietnam/1203/2004（V），其HA效價(jià)都為1∶256，108TCID50/m L，由香港大學(xué)陳鴻霖教授惠贈。

1.1.2 動物：由美國引進(jìn)去勢雪貂（Mustela Pulourius Furo）6只，4～10月齡，500～1200 g。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行血清學(xué)檢查，HI方法檢測 H1N1，H5N1抗體，抗體陰性為合格雪貂方可入組實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 試劑：RNA提取試劑盒 RNeasy Mini Kit購自QIAGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System購自Invitrogen公司，熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix，48孔0.2 mL PCR反應(yīng)管 Fast Optical 48-well RXN Plate，及光學(xué)反應(yīng)蓋膜48-Well Optical Adhesive Film 25PK均購自ABI公司，實(shí)時熒光定量 PCR儀為 ABI公司StepOne系列產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雪貂的感染性

實(shí)驗(yàn)在本所的BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。將6只雪貂隨機(jī)分為2個組，每個滴度3只，每籠一只。將雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉，將流感 A/Vietnam/ 1203/2004病毒株分別以103TCID50和104TCID50滴鼻感染，每只雪貂鼻孔內(nèi)均勻滴入500 uL病毒液。獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中正常飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)的觀察期為5 d。

1.2.2 皮下芯片植入

實(shí)驗(yàn)開始前2周，雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉后，皮下植入芯片，通過芯片錄入實(shí)驗(yàn)動物編號，每日讀取動物體溫?cái)?shù)值。

1.2.3 臨床觀察和取樣

實(shí)驗(yàn)開始前1周每日記錄雪貂體溫及體重變化作為感染前背景資料。感染后每天記錄體溫、體重變化、觀察并記錄有無咳嗽、流涕、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲缺乏等臨床表現(xiàn)。感染前0 d，感染后第1～5天取鼻甲骨活檢物測定病毒載量和病毒滴度。感染后第5天安樂處死動物，取動物氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織測定病毒病毒滴度，做病理檢查。

1.2.4 病毒滴度的測定

雪貂取肺組織、腸組織放入1 m L DMEM（青霉素、鏈霉素各1000 IU/m L）液中，用勻漿器將組織研磨成乳劑，3000 r/min離心10 min，取上清。組織上清液10×連續(xù)稀釋至10-8，接種于單層培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個稀釋度接種4個重復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中35℃靜止培養(yǎng)，觀察記錄各孔細(xì)胞病變（CPE）情況，連續(xù)觀察3 d，用1％火雞血球復(fù)檢，出現(xiàn)凝集反應(yīng)的結(jié)果為陽性。按照 Reed-Muench方法計(jì)算感染雪貂臟器病毒的TCID50。

1.2.5 病理學(xué)檢查

大體觀察，處死動物后，詳細(xì)觀察氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織的形態(tài)變化；病理切片制備，取處死動物的肺等組織，10％甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)病理組織切片處理后，HE方法染色，鏡檢觀察。

1.2.6 PCR檢測

鼻甲骨活檢物可以直接應(yīng)用試劑盒RNeasy kit （Qiagen）提取 RNA。鼻甲骨活檢物溶于 1 m L DMEM培養(yǎng)基中，RNA最終濃度溶入無RNA酶的水中。總RNA中取8μL RNA應(yīng)用SuperScriptⅢReverse Transcriptase（Invitrogen）逆 轉(zhuǎn) 錄。取cDNA2μL應(yīng)用Power SYBR Green PCR Master Mix （ABI）作 定 量PCR。引 物：NP688Fwd5’-ttccaaacagcagcacaaag-3’ ， NP817Rvs25’-tatgggc caatgatcctctc-3’。程序：①94℃ for 3 m in；②94℃ for 30 s，③61℃ for 30 s，④72℃ for 30 s（②-④運(yùn)行35個循環(huán)），⑤95℃，15 s；⑥60℃，1 m in；此后運(yùn)行溶解曲線程序，95℃，15 s，60℃，1 min；95℃，15 s。熒光定量PCR儀可直接讀取病毒載量結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 雪貂感染后體重變化

雪貂感染后出現(xiàn)體重下降，103TCID50組和104TCID50組由感染后第1天一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，104TCID50組在感染后體重下降最高達(dá)20％以上，體重變化見表1。雪貂感染后體重變化率見圖1。

圖1 雪貂感染后體重變化率（％）Fig.1 Body weight change of ferrets（％）體重變化率％=（當(dāng)天體重-0天體重）/0天體重*100％Weight change rate％=（the day weight-0 day weight）/0 day weight*100％

2.2 雪貂感染后體溫變化

雪貂感染后出現(xiàn)體溫升高，與感染前比較體溫最高上升2℃。103TCID50和104TCID50組雪貂在感染后第2天出現(xiàn)體溫升高，一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（感染后第5天），體溫變化見圖2。

圖2 雪貂感染后體溫變化（℃） Fig.2 Body temperature change（℃）

2.3 雪貂感染后臨床表現(xiàn)

雪貂感染然后表現(xiàn)為

臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：NIH提供的雪貂感染實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)分為鼻部癥狀和活動度兩個部分，具體指標(biāo)見表1。

表1 雪貂感染后臨床評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Criteria for clinical sign score

雪貂感染后出現(xiàn)以活動度下降為主臨床改變，即表現(xiàn)為不活躍、對外界刺激的反應(yīng)性下降，上呼吸道感染的癥狀如：打噴嚏、流鼻涕、呼吸困難的癥狀幾乎觀察不到。具體到2個劑量組的反應(yīng)可以看到104TCID50組癥狀要明顯較103TCID50組嚴(yán)重，也主要是以活動度下降為表現(xiàn)的改變。其中103TCID50組雪貂感染后第4天2#死亡，104TCID50組雪貂感染后第5天6#死亡，特別值得注意的是感染雪貂死亡前臨床沒有出現(xiàn)突然地體溫升高、呼吸急促、呼吸困難等癥狀。雪貂感染后臨床變化情況見圖3。

圖3 雪貂感染后臨床表現(xiàn)評分Fig.3 Score of clinical sign

2.4 感染雪貂病理變化結(jié)果

雪貂感染H5N1病毒第5天后肺組織大體呈現(xiàn)多個肺葉腹側(cè)面和背側(cè)面出現(xiàn)片狀灶狀的壞死灶和出血灶，其他組織大體觀察未發(fā)現(xiàn)明顯異常。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肺組織呈炎性充血、出血、水腫、壞死、滲出的重度肺炎病理改變。大腦組織可見局灶性腦炎，血管周圍炎細(xì)胞呈“套袖”裝浸潤，可見小灶狀壞死。免疫組化染色可以觀察到，盡管小腸組織沒有觀察到病變，在肺組織、腦組織、小腸組織均可以看到被病毒感染的陽性細(xì)胞，見彩插5圖4。

表2 雪貂感染后鼻甲骨活檢物病毒培養(yǎng)滴度情況（單位：log10 TCID50） Tab.2 Virus detection and titration in samples from nasal cavity（log10 TCID50）

表3 雪貂感染后組織病毒培養(yǎng)滴度情況（單位：log10 TCID50）Tab.3 Virus culture from tissues of ferrets（log10 TCID50）

2.5 感染雪貂病毒的復(fù)制及釋放

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒滴度測定，結(jié)果顯示103TCID50組雪貂在感染后第2～3天檢測到病毒，病毒滴度為102.3～103.8TCID50。104TCID50組雪貂在感染后第1～5天都檢測到病毒，病毒滴度為 102.3～103.8TCID50。病毒分離結(jié)果顯示雪貂在感染后上呼吸道排毒是呈現(xiàn)隨感染的天數(shù)逐漸上升的趨勢，即表示病毒在上呼吸道不斷復(fù)制排出。這與溫和的季流病毒比較有明顯的不同，H3N2病毒株感染后通常會出現(xiàn)上呼吸道的病毒排出隨天數(shù)增加而下降，H5N1作為高致病流感病毒株致死率高可能與這個結(jié)果有一定的關(guān)系。鼻甲骨活檢物病毒滴度結(jié)果見表2。

雪貂在感染后第5天安樂處死，取雪貂氣管、肺、心、肝、脾、腎、小腸、腦組織做病毒滴度測定。結(jié)果顯示各個組織都能夠分離到病毒，其中以氣管和肺組織的病毒滴度最高，103TCID50組雪貂病毒分離的陽性率為5/24，104TCID50組雪貂病毒分離的陽性率為13/24。以上的結(jié)果反映了H5N1病毒感染雪貂，呼吸系統(tǒng)的器官是病毒侵襲的重要對象，呼吸系統(tǒng)以外的器官也會受到病毒的攻擊，并且病毒可以突破血腦屏障感染腦組織，這就解釋了為什么感染禽流感病毒病人會出現(xiàn)多系統(tǒng)多器官受損和出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。各組織臟器病毒滴度結(jié)果見表3。

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒載量測定，結(jié)果顯示103TCID50組和104TCID50組雪貂在感染后第1天至感染后第5天，病毒載量呈現(xiàn)曲線上升的趨勢，這與病毒分離的結(jié)果是相一致的，結(jié)果見圖5。

3 討論

圖5 雪貂鼻中病毒載量變化Fig.5 Virus loading on nose of ferrets infected

H5N1型高致病情流感傳播途徑主要有兩種，通過水禽或其污染物直接傳到人或通過中間宿主（如：豬）傳到人。人感染高致病性禽流感后，起病很急，早期表現(xiàn)類似普通型流感。主要表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫大多在39℃以上，持續(xù)1～7 d，一般為3～4 d，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、頭痛、全身不適，部分患者可有惡心、腹痛、腹瀉、稀水樣便等消化道癥狀，極少數(shù)會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。高致病禽流感感染死亡率超過60％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A/Vietnam/1203/2004人源H5N1型禽流感病毒可以感染雪貂，應(yīng)用的病毒滴度死亡率為33％。感染后在雪貂除氣管和肺組織還可在心、肝、脾、腎、小腸、腦組織中分離到病毒。說明該病毒能夠侵染雪貂的肺、腦、肝、腎等多種器官并造成神經(jīng)系統(tǒng)感染，這與感染人的H5N1禽流感病毒毒株具有共同的特性［9-10］。雪貂鼻甲骨活檢物病毒分離結(jié)果顯示病毒在感染后第2天至第5天呈現(xiàn)上升的趨勢，病毒載量的結(jié)果與此結(jié)果相一致，這與溫和型的季節(jié)性流感H3N2在雪貂上的表現(xiàn)不一致（病毒釋放呈逐天下降的趨勢）［2］。這可能也是雪貂感染后持續(xù)體溫升高，體重嚴(yán)重下降，活動度下降的原因之一。雪貂的臨床癥狀出現(xiàn)的早晚和嚴(yán)重程度與接毒量有關(guān)，接毒量大的雪貂體重下降快，癥狀出現(xiàn)早，體重下降多；隨接毒量減少癥狀出現(xiàn)漸晚，癥狀減輕。因此，有理由推斷，即使H5N1型禽流感在人間大流行，因個體差異和接觸病毒量的差別，其致病性也會有所差異。感染后雪貂解剖發(fā)現(xiàn)肺組織呈炎性充血、出血、水腫、壞死、滲出的重度肺炎病理改變，腦組織的組化染色中可以觀察到被病毒感染的陽性細(xì)胞。

雪貂對該H5N1型禽流感病毒呈現(xiàn)出規(guī)律的與人類感染流感病毒相似的以肺炎為主的臨床癥狀、典型的病理變化和高致死率，是良好的H5N1相關(guān)研究的動物模型。

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