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    氣管插管法接種H5N1病毒感染恒河猴及系統(tǒng)組織病毒檢測(cè)

    2011-02-03 07:38:14鮑琳琳許黎黎李楓棣占玲俊
    關(guān)鍵詞:病毒血癥恒河洗液

    呂 琦,鄧 巍,鮑琳琳,許黎黎,李楓棣,陳 霆,占玲俊,秦 川

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

    高致病性禽流感病毒H5N1的危害不僅在于其能夠引起禽類的大量死亡,更嚴(yán)重的是它跨越了物種屏障,多次造成人類感染并引起死亡,致死率高達(dá)60%以上[1,2]。人類感染禽流感的風(fēng)險(xiǎn)也隨著全球動(dòng)物禽流感疫情的不斷增加而增大,應(yīng)該引起重視的是,隨著病毒的不斷變異,能導(dǎo)致人間傳播的可能性也在增加,因此對(duì)禽流感發(fā)病機(jī)制研究,以及藥物和疫苗的評(píng)價(jià)篩選成了當(dāng)務(wù)之急,而這些研究都需要合適的動(dòng)物模型。非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以其具有與人類最為相似的生理結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)應(yīng)答,已被用作禽流感感染動(dòng)物模型,但有文獻(xiàn)報(bào)道該模型對(duì)H5N1病毒的敏感性較低[3,4],不能完全模擬人類重癥患者的發(fā)病特征。考慮到感染途徑最有可能影響感染效果,本研究探索應(yīng)用氣管插管的新式感染H5N1病毒方法感染恒河猴,旨在改良以往模型的低敏感性,并密集動(dòng)態(tài)檢測(cè)病毒在體內(nèi)的分布,為深入研究禽流感發(fā)病機(jī)制,篩選有效疫苗和治療藥物提供一個(gè)良好的技術(shù)平臺(tái)。考慮到人源H5N1的高度致病性和感染大動(dòng)物生物安全的控制要求,本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用2只恒河猴,在病毒復(fù)制和疾病凸顯節(jié)點(diǎn)安樂處死動(dòng)物,系統(tǒng)檢測(cè)多項(xiàng)組織病毒分布。

    1 材料和方法

    1.1 病毒毒株

    高致病性禽流感病毒H5N1 A/SZ/406H/2006株,由WHO惠贈(zèng),在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)10日齡SPF級(jí)雞胚傳代擴(kuò)增,MDCK細(xì)胞測(cè)定TCID50為108/m L,液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 動(dòng)物

    恒河猴(許可證號(hào):IACUC-MC-07-6011)年齡5歲,雄性,2只,動(dòng)物編號(hào)為001和002。H5N1、H1N1和季節(jié)性流感病毒抗體經(jīng)檢測(cè)均呈陰性。實(shí)驗(yàn)前恒河猴麻醉后將體溫芯片植入其頸部后方、肩胛骨上方的背中線位置,每天用數(shù)據(jù)收集器掃描芯片來測(cè)量猴的體溫。

    1.3 方法

    1.3.1 病毒感染:感染前按照10 mg/kg復(fù)方氯胺酮肌肉注射給予猴麻醉,待恒河猴肌肉徹底放松后,將其放置仰臥位,用喉鏡撐開會(huì)厭,通過氣管插管將2 m L H5N1(2x108TCID50)病毒液滴入上呼吸道。所有操作均在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成(許可證號(hào):ⅡBSL3-006)。

    1.3.2 臨床觀察:每天從以下幾方面觀察恒河猴的感染后癥狀:(1)體溫,每天上午相同時(shí)間點(diǎn)通過芯片讀取體溫;(2)鼻部癥狀,有無流涕;(3)上呼吸道癥狀,有無咳嗽、氣促、呼吸困難;(4)消化道癥狀,有無嘔吐、腹瀉;(5)攝食量,有無明顯食欲缺乏;(6)精神狀態(tài),有無精神萎靡及活動(dòng)度減退等癥狀。

    1.3.3 取樣:恒河猴感染1 d后,每天采集其咽拭子和鼻灌洗液放入1 m L DMEM溶液中,2 000 r/m in離心10 min取上清液,-80℃保存待檢。感染前2 d、感染后第3、5和7天分別靜脈取血,血液放置30 min后,2 000 r/min離心10 min,-80℃保存待檢。感染第3天和第7天各解剖1只恒河猴,取支氣管淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)、鼻甲、心、肝、脾、肺、腎、腸、氣管、腦組織,每個(gè)組織各剪取50 mg左右兩小塊,一塊放入1 m L DMEM中用于病毒分離,另一塊放入1 m L buffer RLT(Qiagen,已加入1%巰基乙醇)用于核酸載量檢測(cè),研磨成組織勻漿后3 000 r/min離心10 min,取上清-80℃保存待檢。

    1.3.4 病毒分離和核酸載量的檢測(cè):病毒分離方法:取咽拭子鼻灌洗液處理后溶液、血清及組織勻漿上清100μL接種于鋪滿75%以上MDCK細(xì)胞的24孔板中,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)兩個(gè)正常細(xì)胞對(duì)照孔,置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。1 h后DMEM培養(yǎng)液洗1次,加入1.9 m L病毒生長(zhǎng)液后再次置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞病變(CPE),持續(xù)觀察7 d,如無CPE,將原代24孔板培養(yǎng)物-80℃凍融2次再盲傳二代,共盲傳三代后仍不出現(xiàn)CPE視為陰性,血凝實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。核酸載量檢測(cè)方法:取咽拭子鼻灌洗液處理后溶液、血清及組織勻漿上清100μL放入250μL RLT中,按Qiagen試劑盒法提取樣品RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen),通過熒光定量PCR儀直接測(cè)定病毒載量(RT-PCR試劑盒購(gòu)自ABI)。病毒分離及RNA提取操作步驟均在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

    1.3.5 血常規(guī):血常規(guī)檢測(cè)感染前2 d感染后第3、5和7天靜脈采集的恒河猴血液。

    2 結(jié)果

    2.1 臨床癥狀

    感染后第2天恒河猴攝食量開始減少、自主活動(dòng)減少。感染后第1天體溫達(dá)到峰值,第3天時(shí)回落至正常范圍,除以上癥狀外恒河猴未出現(xiàn)其他明顯臨床表現(xiàn)(圖1)。

    圖1 感染后恒河猴體溫變化情況Fig.1 Body temperature of the monkeys post-infection

    2.2 病毒分離和載量的檢測(cè)

    2.2.1 鼻灌洗液和咽拭子的病毒分離和核酸載量檢測(cè)結(jié)果:H5N1感染1 d后,每天采集鼻灌洗液和咽拭子至第7天,病毒培養(yǎng)鼻灌洗液除第4、5天為陰性結(jié)果外,其余均為陽性。咽拭子除第7天為陰性外第1~6天均為陽性(表1)。病毒陽性的細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為:腫脹圓化,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞核固縮或破裂,細(xì)胞部分或全部脫落,血凝實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞也發(fā)生凝集現(xiàn)象。病毒載量結(jié)果顯示鼻灌洗液及咽拭子于感染后第1天載毒最高,此后逐漸下降(表2)。

    2.2.2 血液的病毒分離和核酸載量檢測(cè)結(jié)果:恒河猴感染H5N1病毒前2 d及感染后第3、5和7天靜脈取血,002號(hào)恒河猴在感染后第3天血液中H5N1病毒分離成陽性,血凝實(shí)驗(yàn)復(fù)檢結(jié)果一致。核酸載量也達(dá)104copies/m L(表3)。

    2.2.3 組織器官的病毒分離和核酸載量檢測(cè)結(jié)果:H5N1感染后第3天和第7天各安樂一只恒河猴,剖取支氣管淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)、鼻甲、心、肝、脾、肺、腎、腸、氣管、腦組織進(jìn)行病毒分離和核酸載量檢測(cè)。除肺組織外,在恒河猴的心,氣管,腦,肝,腎,腸多處組織器官中也能分離到H5N1病毒(表4),血凝試驗(yàn)復(fù)檢結(jié)果一致。病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示,所取組織中均存在高達(dá)105~107copies/g的H5N1核酸拷貝(表5)。

    2.3 血常規(guī)

    恒河猴感染H5N1病毒前2 d及感染后第3、5、7天采靜脈血,進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),結(jié)果如表6所示。感染后與感染前相比恒河猴白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)下降,其他指標(biāo)均無明顯變化。

    表1 感染后恒河猴鼻灌洗液和咽拭子的病毒分離情況Tab.1 Virus isolation in the throat swab and nasal wash obtained from rhesusmacaques post-infection

    表2 感染后恒河猴鼻灌洗液和咽拭子的病毒載量 單位:log10(copies/g) Tab.2 RT-PCR Resultsof the throat swab and nasal wash obtained from rhesusmacaques post-infection(log10 copies/g)

    表3 感染后恒河猴血液的病毒分離和病毒載量(病毒分離/病毒載量 單位log10(copies/m L)) Tab.3 Virus isolation and RT-PCR Results of the blood obtained from rhesusmacaques post-infection(Virus isolation/RT-PCR log10 copies/m L)

    表4 感染后恒河猴組織樣品的病毒分離情況Tab.4 Virus isolation in organ tissues obtained from the rhesusmacaques post-infection

    表5 感染后恒河猴組織樣品的病毒載量 單位:log10(copies/g) Tab.5 RT-PCR Results of the organ tissues obtained from rhesus macaques post-infection(log10 copies/g)

    表6 感染后恒河猴血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)的變化Tab.6 Changes of blood physiological parameters in the rhesus macaques post-infection

    3 討論

    Yunxin Chen、代小偉等[3,4]人已成功建立了H5N1感染恒河猴模型,但病理變化以及病毒學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示H5N1只能在呼吸系統(tǒng)復(fù)制,恒河猴感染敏感性較低。針對(duì)以上不足本研究嘗試性選取了一種新的感染方法及一株人源高致病性H5N1病毒經(jīng)氣管插管滴入的方式感染恒河猴,通過分析臨床癥狀、病毒分離情況、血常規(guī)變化等檢測(cè)指標(biāo),研究此方法感染恒河猴的臨床及病毒變化,為H5N1的深入研究及提供更具理論指導(dǎo)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的動(dòng)物模型做前期摸索。

    人感染禽流感病毒后的癥狀表現(xiàn)為多樣化[1,2],從臨床癥狀分析本實(shí)驗(yàn)感染后的恒河猴出現(xiàn)一過性體溫升高、攝食量減少、自主活動(dòng)減少,表現(xiàn)為普通型的流感癥狀,并未出現(xiàn)其他明顯臨床癥狀。從病毒分離和核酸載量檢測(cè)結(jié)果看,氣管插管法感染的這株人源H5N1病毒侵襲機(jī)體的特點(diǎn)是系統(tǒng)性的,恒河猴全身多組織臟器包括心、肝、腎、小腸、氣管和腦都能分離到病毒,不僅局限于肺部。而之前建立的H5N1感染恒河猴模型在急性感染期只有肺組織分離到病毒,引起這種差別的主要原因可能包括三方面:

    首先,造成肺外感染的原因可能是感染途徑的不同,Rimmelzwaan等[6]人利用滴鼻、上呼吸道感染和左右眼球感染,這種聯(lián)合攻毒方式導(dǎo)致動(dòng)物所表現(xiàn)的臨床癥狀和組織病理學(xué)都嚴(yán)重于只滴鼻感染的獼猴。對(duì)于同樣是呼吸道感染方式,環(huán)甲膜穿刺對(duì)于機(jī)體有一定的微創(chuàng)性,并造成黏膜損傷,可能對(duì)病毒結(jié)合呼吸道受體有一定影響,而本研究所采用的氣管插管可直接定位于上呼吸道,能準(zhǔn)確控制感染劑量,對(duì)機(jī)體是無創(chuàng)性的,是很好的感染途徑。

    其次,病毒來源不同也會(huì)造成病毒侵襲力的不同,Hualan Chen等人將三種不同來源的H5N1病毒株以3滴鼻方式等劑量感染恒河猴[7],只有感染了其中一種病毒的恒河猴出現(xiàn)了肺外感染。本實(shí)驗(yàn)采用的高致病性禽流感病毒H5N1為一株人源毒株,而此前感染的毒株多為禽源性,因不同毒株致病力有所不同,所以導(dǎo)致了病毒對(duì)于機(jī)體侵襲力的不同。

    恒河猴體內(nèi)出現(xiàn)的病毒血癥提示血液的流通可能將病毒帶到了各個(gè)組織臟器中,病毒血癥出現(xiàn)的原因至今尚不清楚,根據(jù)Menno Dde Jong等人將感染H5N1的患者與感染兩種人季節(jié)性流感病毒的患者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),感染H5N1患者咽部病毒載量顯著高于季流患者,病死H5N1患者體內(nèi)病毒載量水平最高,并在死亡患者血液中可以檢測(cè)到H5N1病毒。本實(shí)驗(yàn)中恒河猴咽部分離的病毒載量也相對(duì)較高,但咽部的高病毒載量是否與病毒血癥具有相關(guān)性還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通常病毒血癥的出現(xiàn)一般在致死性的重癥感染中[3,5],而本實(shí)驗(yàn)猴只出現(xiàn)了輕微的臨床癥狀,可見病毒血癥的出現(xiàn)并不一定會(huì)造成嚴(yán)重的癥狀。在本實(shí)驗(yàn)中只有一只猴出現(xiàn)病毒血癥,考慮到采血時(shí)間過于密集會(huì)導(dǎo)致猴的生理?yè)p傷而影響結(jié)果的判定,所以并不排除另一只猴因采血時(shí)間點(diǎn)的不密集也出現(xiàn)過病毒血癥。

    對(duì)于H5N1感染腦部的病毒分離結(jié)果,之前Haeman J基于小鼠的實(shí)驗(yàn)顯示[8],H5N1型禽流感病毒具有嗜神經(jīng)性,可以感染包括腦細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞,能夠引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)聚集紊亂,導(dǎo)致帕金森和老年癡呆癥。他們還發(fā)現(xiàn),禽流感的致死性更在于其肺外組織感染能力,尤其是大腦。本實(shí)驗(yàn)中也在感染急性期的恒河猴腦部中分離到H5N1病毒,進(jìn)一步用基于非人靈長(zhǎng)類的動(dòng)物模型驗(yàn)證了H5N1能夠跨越血腦屏障這一推測(cè)。

    經(jīng)氣管插管感染的恒河猴感染急性期全身多組織臟器都可分離到H5N1病毒,血液中也出現(xiàn)了病毒血癥,而禽流感的致死性之一也在于其肺外傳播能力,導(dǎo)致的多組織、臟器損傷,并且病毒血癥可能就是造成這種傳播的主要原因,所以氣管插管感染的恒河猴對(duì)于進(jìn)一步研究H5N1病毒的致病機(jī)制,及病毒血癥與病毒體內(nèi)傳播的相關(guān)性具有重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價(jià)值。

    由于人源H5N1具有高度致病性,特別是進(jìn)行感染大動(dòng)物時(shí),如實(shí)驗(yàn)猴,生物安全控制要求非常嚴(yán)格,因此,本試驗(yàn)僅使用2只恒河猴,在病毒復(fù)制和疾病凸顯節(jié)點(diǎn)安樂處死動(dòng)物,密集檢測(cè)多項(xiàng)組織中的病毒分布,初步了解了該方法的有效性和感染病毒的特性,為更深入、全面建立動(dòng)物模型等提供了良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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