營養(yǎng)不良性肺水腫大鼠肺泡液體清除機制的研究

李乃靜，李 偉，谷 秀，李勝岐，何 平

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，3呼吸科，遼寧，沈陽 110004； 2.沈陽藥科大學(xué)藥物分析教研室，遼寧，沈陽 110016）

肺泡上皮具有阻止液體進入肺泡腔內(nèi)和主動清除肺泡腔內(nèi)液體的作用，是抵抗肺水腫形成的一道重要屏障。臨床上多種消耗性疾病可以造成肺損傷，引起肺泡上皮屏障的破壞，通透性增加，出現(xiàn)肺水腫［1，2］。但有關(guān)在營養(yǎng)不良病理狀態(tài)下肺泡上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能的變化尚缺乏深入的研究。本實驗探討營養(yǎng)不良對肺泡上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能的影響，并觀察鈉通道阻斷劑、Na+-K+-ATP酶阻斷劑及β受體激動劑對營養(yǎng)不良性肺水腫大鼠肺泡液體清除功能的影響，旨在為早期治療營養(yǎng)不良性肺水腫提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

動物：雄性Wistar大鼠（體重300～330 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（遼）2003-0019）。藥物：β2腎上腺素能受體激動劑特布他林、鈉通道阻斷劑氨氯吡咪、Na-K-ATP酶阻斷劑哇巴因購于美國Sigma公司。

1.2 營養(yǎng)不良大鼠動物模型的制備［3］

大鼠自由攝取水，但禁食。正常對照組大鼠自由攝取水和食物。

1.3 分組及方法

將動物隨機分組，每組動物10只，共12組。

1.3.1 營養(yǎng)不良對大鼠肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance，AFC）的影響：分別測定禁食48 h、120 h大鼠及正常對照組大鼠總肺水量（lung water content，TLW）、肺血管外水量（extravascular lung water，EVLW）和肺泡液體清除率，并取部分肺組織浸入4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，普通光鏡觀察肺組織形態(tài)。

1.3.2 鈉通道阻斷劑氨氯吡咪的作用：將5×10-4mol/L氨氯吡咪加入5％白蛋白等滲生理鹽水溶液5 m L/kg灌注到禁食120 h大鼠（A1組）及正常大鼠（A2組）氣管內(nèi)，測定AFC。

1.3.3 Na-K-ATP酶阻斷劑哇巴因的作用：5× 10-4mol/L哇巴因加入5％白蛋白等滲生理鹽水溶液5 m L/kg灌注到禁食120 h大鼠（B1組）及正常大鼠（B2組）氣管內(nèi)，測定AFC。

1.3.4 氨氯吡咪和哇巴因的聯(lián)合作用：將5×10-4mol/L氨氯吡咪和5×10-4mol/L哇巴因加入5％白蛋白等滲生理鹽水溶液5 m L/kg灌注到禁食120 h大鼠（C1組）及正常大鼠（C2組）氣管內(nèi)，測定AFC。

1.3.5 β2腎上腺素能受體激動劑特布他林的作用：將10-5mol/L特布他林加入5％白蛋白等滲生理鹽水溶液5 m L/kg灌注到禁食120 h大鼠（D1組）及正常大鼠（D2組）氣管內(nèi)，測定AFC。

1.3.6 進食后營養(yǎng)不良大鼠AFC的變化：營養(yǎng)不良大鼠禁食120 h后自由攝取水和食物，72 h測定AFC（E組）。

1.4 指標測定

1.4.1 AFC的測定：將大鼠用10.0％水合氯醛0.03 m L/10g體重的計量進行腹腔麻醉，氣管切開后進行氣管插管。腹主動脈放血處死大鼠，將氣管、肺臟、心臟全部取出。用保鮮膜包被后放入37℃水浴箱中孵育。通過氣管導(dǎo)管將Evans藍標記（0.15 mg/mL）標記的5％白蛋白等滲生理鹽水溶液以5 m L/kg體重灌入大鼠氣管內(nèi)。并給予4 mL的氮氣以確保灌注液到達肺臟。并且持續(xù)給予10％的氧氣，使氣道內(nèi)保持7 cm H2O的氣道壓力，孵育1 h后通過分光光度儀，在波長620 nm處測定Evans藍標記的白蛋白濃度。AFC計算公式如下［3］：AFC（％）=（Vi Vf）/Vi×100，Vf=Vi×Pi/ Pf，式中Vi和Vf分別代表起始和最終肺泡液體總量，i表示灌注前，f表示孵育1h后吸出的肺泡灌洗液體積。P是Evans藍標記的白蛋白濃度。

1.4.2 肺組織含水量測定：TLW和EVLW的測定采用Noble法并加以改動［4］，公式如下：

TLW=（肺濕重-肺干重）/肺干重

每克濕肺含殘血量=（勻漿液Hb÷血液Hb） ×勻漿總樣本量×1.055/勻漿肺質(zhì)量

濕肺含殘血量=肺濕重×每克濕肺含殘血量EVLW=（肺濕重-肺干重-濕肺含殘血量）/肺干重

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理表現(xiàn)

正常對照組及禁食大鼠病理表現(xiàn)及TLW及AFC基礎(chǔ)值：正常對照組大鼠的肺泡腔基本干燥，肺間質(zhì)無水腫，肺泡周圍血管無擴張、充血（圖1）；禁食48 h大鼠可見到肺泡周圍血管擴張、淤血（圖2）。禁食120 h大鼠可見到肺間質(zhì)增寬、淤血，出現(xiàn)肺水腫（圖3）（圖1～3見封三）。

表1 營養(yǎng)不良對大鼠TLW、ELVW及AFC的作用（x±s，n=10）Tab.1 Effects ofmalnutrition on TLW，EVLW and AFC in the rats（x±s，n=10）

2.2 營養(yǎng)不良對TLW、EVLW及AFC的作用

見表1。TLW及EVLW均隨著大鼠禁食時間的延長而增加，禁食48 h、120 h大鼠TLW及EVLW與對照組比較差異有顯著性。但是禁食48 h內(nèi)大鼠AFC與對照組比較差異無顯著性。

2.3 藥物對AFC的作用

藥物對禁食120 h大鼠的作用結(jié)果分別為：A1組（6.02±1.56）％；B1組（6.84±2.44）％；C1組（4.34±2.30）％；D1組：（24.3±3.82）％；A1、B1組AFC與禁食120 h大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯降低（P均＜0.05），C1組AFC與禁食120 h大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯降低（P＜0.01），D1組AFC與禁食120 h大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯增加（P＜0.05）。藥物對正常對照組大鼠AFC的作用結(jié)果分別為：A2組（7.59±2.78）％；B2組（10.7±1.57）％；C2組（6.04±3.19）％；D2組（25.8±2.08）％，A2、B2組AFC與正常對照組大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯降低（P均＜0.05），C2組與正常對照組大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯降低（P＜0.01），D2組AFC與正常對照組大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯增加（P＜0.05）；D1組AFC與D2組AFC比較差異沒有顯著性（P＞0.05），說明特布他林對正常對照組大鼠及禁食120 h大鼠AFC的作用差異無顯著性。E組AFC結(jié)果為：12.9％±2.07％，與營養(yǎng)不良120 h大鼠基礎(chǔ)AFC比較明顯升高（P＜0.05），是正常對照組大鼠基礎(chǔ)AFC的70％。

3 討論

伴隨著肺泡上皮離子轉(zhuǎn)運功能和水通道的發(fā)現(xiàn)，對肺水腫和肺損傷的發(fā)生機制有了更深刻的理解。即液體通過肺泡上皮屏障的運動并不完全依賴靜力的被動變化和肺毛細血管的滲透性，肺泡上皮所具有的主動轉(zhuǎn)運功能對于保持肺泡干燥和進行有效的氣體交換起著至關(guān)重要的作用［5，6］。臨床上許多危重癥患者存在營養(yǎng)不良，嚴重者可以發(fā)生肺水腫。而有關(guān)營養(yǎng)不良導(dǎo)致肺損傷和肺水腫的具體機制尚缺乏深入了解。本實驗結(jié)果表明營養(yǎng)不良亦可以導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生。大鼠禁食48 h即出現(xiàn)肺泡周圍血管擴張、淤血等肺損傷的表現(xiàn)，總肺水量和肺血管外水量增加。且隨著營養(yǎng)不良時間的延長肺臟損傷程度越來越重，到120 h出現(xiàn)間質(zhì)性肺水腫，總肺水量和肺血管外水量進一步增加。該實驗表明營養(yǎng)不良大鼠在肺組織含水量明顯增加的情況下肺泡液體清除率依然可以維持正常。一般如果EVLW能夠保持在5～6 g/g以下，則肺泡上皮細胞液體清除功能可以維持在正常水平［7］。

以鈉通道阻斷劑氨氯吡咪和Na-K-ATP酶阻斷劑哇巴因能夠降低正常大鼠及營養(yǎng)不良大鼠肺泡液體清除率，說明肺泡上皮細胞不僅參與生理情況下鈉水的調(diào)節(jié)亦參與肺損傷后鈉水的轉(zhuǎn)運，清除肺泡腔內(nèi)過多液體，避免水腫液的聚集。肺泡上皮細胞的這一功能主要是通過鈉主動轉(zhuǎn)運來實現(xiàn)的，鈉的主動轉(zhuǎn)運由鈉通道和Na+-K+-ATP酶共同完成，即由上皮細胞的鈉通道攝取Na+，然后經(jīng)由基底膜上的Na+-K+-ATP酶將Na+泵至肺間質(zhì)同時伴隨水的吸收，以保持肺泡腔相對干燥的環(huán)境和進行有效的氣體交換［8，9］。在氨氯吡咪的作用下，禁食120 h大鼠和正常大鼠肺泡液體清除率分別下降了31％和59％，在哇巴因的作用下，營養(yǎng)不良大鼠和正常大鼠肺泡液體清除率分別下降了28％和42％。說明禁食120 h大鼠肺泡液體清除率的降低與在營養(yǎng)不良狀態(tài)下鈉通道和Na+-K+-ATP酶的活性部分被抑制有關(guān)。

本實驗結(jié)果表明營養(yǎng)不良大鼠重新進食后72 h，肺泡液體清除率恢復(fù)了70％，說明禁食120 h并未造成大鼠肺泡液體清除功能不可逆的損傷。肺損傷后的肺泡上皮液體清除能力與損傷程度有關(guān)，肺損傷后，最早出現(xiàn)的是內(nèi)皮細胞的損傷，導(dǎo)致血管周圍液體的集聚，出現(xiàn)間質(zhì)性肺水腫。說明與內(nèi)皮細胞相比，肺泡上皮細胞有著更強的抗損傷能力［10］。只要肺泡上皮屏障未受到破壞肺泡液體清除能力可以維持正常。但如果肺泡上皮緊密連接損傷后細胞旁的通透性增加，則肺泡液體清除能力減退。肺泡上皮屏障功能可以作為判定肺損傷后，肺水腫恢復(fù)程度的一個指標。即使肺臟受到損傷，只要肺泡上皮屏障未受到破壞，肺泡液體清除率正常肺泡上皮一定能夠完成鈉、水的轉(zhuǎn)運，清除肺內(nèi)過多的液體。一般能在損傷12 h內(nèi)吸收一些水腫液的患者恢復(fù)快，死亡率低。相反，則恢復(fù)慢，死亡率高［11］。營養(yǎng)不良大鼠肺泡上皮細胞對β2腎上腺素能受體激動劑特布他林的反應(yīng)與對照組比較差異無顯著性，說明在輕、中度肺損傷時，肺泡上皮細胞β2腎上腺素能受體并沒有遭到破壞。同時也說明，特布他林能夠通過調(diào)節(jié)肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運功能，加速肺水腫液的吸收。肺泡上皮在輕、中度損傷的情況下仍對鈉水具有主動轉(zhuǎn)運功能，為臨床上通過調(diào)節(jié)鈉水轉(zhuǎn)運治療肺水腫奠定了理論基礎(chǔ)。輕、中度肺損傷時，肺泡上皮細胞對特布他林的反應(yīng)仍然是正常的，進一步說明肺泡上皮細胞依然保持正常的功能。這為臨床早期治療肺水腫或急性肺損傷提供了理論依據(jù)。

本實驗結(jié)果表明營養(yǎng)不良可以導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生，其機制與鈉通道和Na+-K+-ATP酶的活性部分被抑制有關(guān)。提示我們在救治營養(yǎng)不良肺水腫患者時應(yīng)爭取在肺泡上皮屏障未受到完全破壞之前積極補充營養(yǎng)，并使用β2腎上腺素能受體激動劑特布他林等藥物改善肺泡液體清除功能，以免貽誤病情，危及患者生命。attenuates pulmonary edema in rats exposed to 100％oxygen［J］.JAppl Physiol.2000，89：1759-1765.

［2］Berger G，Guetta J，Klorin G，et al.Sepsis impairs alveolar epithelial function by downregulating Na-K-ATPase pump［J］.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol.2011，301：L23-L30.

［3］Sakuma T，Zhao YZ，Sugita M，et al.Malnutrition impairs alveolar fluid clearance in rat lungs［J］.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2004，286：L1268-L 1274.

［4］谷秀，李勝岐，佐久間勉.β腎上腺素能受體激動劑對離體大鼠肺泡液體清除率的作用［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（6）：390-393.

［5］Dada lA，Sznajder JI.Mechanisms of pulmonary edema clearance during acute hypoxemic respiratory failure：role of the Na，K-ATPase［J］.Crit Care Med，2003，6：S248-252.

［6］Berger MM，Pitzer B，Zugel S，et al.Alveolar but not intravenous S-Ketamine inhibits alveolar sodium transport and lung fluid clearance in rats［J］.Anesth Analg，2010，111：164 -170.

［7］Berthiaume Y，Hans G，F(xiàn)olkesson M，et al.Lung edema clearance：20 years of progress［J］.JAppl Physiol，2002，93：2207-2213.

［8］Saldias F，Comellas AP，Pesce L，et al.Dopamine increases lung liquid clearance during mechanical ventilation［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，283：L 136-L143.

［9］Li NJ，LiW，He P，et al.Effect of beta3-adrenergic agonists on alveolar fluid clearance in hypoxic rat lungs［J］.Chin Med J，2010，123：1028-1033.

［10］Crapo J，Barry BD，F(xiàn)oscue HA，et al.Structural and biochemical changes occurring during exposure to lethal and adaptive doses of oxygen［J］.Am Rev Respir Dis，1990，122：L23-43.

［11］Brasch F，Birzele J，Ochs M，et al.Surfactant proteins in pulmonary alveolar proteinosis in adults［J］.Eur Respir J，2004，24：426-435.