SP和CGRP在炎癥性腸病大鼠結(jié)腸中的表達(dá)規(guī)律

張 峰，袁川評(píng)，柳巨雄，曾 林，胡娟峰

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071；2.吉林大學(xué)，長(zhǎng)春 130062）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種在我國(guó)及歐美等諸多國(guó)家極為普遍的慢性胃腸道疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要與環(huán)境、遺傳、免疫等多種因素密切相關(guān)［1］。而胃腸肽類(lèi)激素不僅作為肽能神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，同時(shí)也參與了 IBD發(fā)病的神經(jīng)免疫機(jī)制。其中 P物質(zhì)（substance P，SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）分別作為興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的代表，在IBD發(fā)病中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。為了觀察SP和CGRP在IBD大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)規(guī)律來(lái)探討二者在IBD發(fā)病機(jī)制中的意義，我們采用三硝基苯磺酸 （TNBS）化學(xué)誘導(dǎo)建立IBD大鼠動(dòng)物模型，采用 real-time RT-PCR方法檢測(cè)SP和CGRP于建模后不同時(shí)期（第0、3、7、14、21、28天）結(jié)腸組織中的mRNA表達(dá)水平的變化，為進(jìn)一步確定二者在炎癥性腸病過(guò)程中發(fā)揮重要作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

未成年雌性W istar大鼠60只，體重（120±10） g，清潔級(jí)（由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（吉）2007-0003），隨機(jī)分為PBS對(duì)照組20只，模型組40只。放置于（23± 1）℃、濕度＜60％的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，并正常飲水?dāng)z食。5％三硝基苯磺酸 （trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 建模：采用本實(shí)驗(yàn)室常用建模方法，即對(duì)W istar大鼠進(jìn)行24 h禁食不禁水處理，將5％TNBS與無(wú)水乙醇以體積比2∶1配成混合液，按每只大鼠0.1 m L/100 g對(duì)模型組進(jìn)行直腸灌注［2］，對(duì)照組給予等體積的PBS。灌注后，正常進(jìn)食飲水。

1.2.2 取材：分別于建模后第0、3、7、14、21、28天取結(jié)腸組織，一部分用于固定，進(jìn)行常規(guī)HE染色，一部分用于提取總RNA，進(jìn)行real-time RT-PCR的檢測(cè)。

1.2.3 HE染色：將固定12 h以上的結(jié)腸組織依次通過(guò)酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋后制作5μm厚的連續(xù)切片，然后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察在不同時(shí)期結(jié)腸組織的病理變化。

1.2.4 SP、CGRP和 β-actin的引物和探針引物設(shè)計(jì)：根據(jù) GenBank中大鼠SP、CGRP和β-actin的基因序列設(shè)計(jì)引物，詳見(jiàn)表1。引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司和成。

1.2.5 大鼠 SP、CGRP和 β-actin的克?。喊凑誘rizol使用說(shuō)明提取大鼠結(jié)腸組織總 RNA.以各基因特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，其中反轉(zhuǎn)錄體系為20μL，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣?？俁NA 2 μL，Oligo-dT Primer（10μmol/L）1.0μL，DEPC H2O 9.5μL，5×buffer 4.0μL，dNTPm ixture（2.5 mmol/L）2.0μL，reverse transcriptase（5 U/μL） 1.0μL，RNase inhibitor（40 U/μL）0.5μL.混勻后置于42℃水浴90 min，90℃水浴5 min，冰浴冷卻備用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25μL，具體參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣。H2O 17.5μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPm ixture（2.5 mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，Ex Taq（5 U/μL）0.1μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 m in；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 m in。并將獲得的基因片段連接至pMD18-T，進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序。

表1 大鼠SP、CGRP和β-actin引物和探針序列Tab.1 Primers and probe sequence of SP，CGRP andβ-actin of the rats

1.2.6 SP、CGRP和 β-actin mRNA水平的定量檢測(cè)：對(duì)鑒定正確的GAPDH和IL-6質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)谱?real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，Taqman real-time PCR master mix 12.5μL，上下游引物及探針各1μL，H2O 8.5μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，62℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將備好的結(jié)腸cDNA樣品分別進(jìn)行real time PCR檢測(cè)。用建立的熒光定量PCR測(cè)定，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)給出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的表達(dá)式。他們分別為：β-actin：y=-3.174230x+ 32.527992，R2=0.999347；SP：y=-4.440373x+ 30.221874，R2=0.999013；CGRP：y=-4.383040x +29.985718，R2=0.99922。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用相對(duì)定量即SP或CGRP初始濃度/GAPDH初始濃度表示，根據(jù)樣品熒光定量擴(kuò)增曲線(xiàn)和SPSS13.0軟件分析，得出IBD發(fā)生不同時(shí)期，SP和CGRP mRNA在IBD大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)變化.

圖3 A，結(jié)腸組織的總RNA電泳圖；B、C分別為β-actin，CGRP和SP的擴(kuò)增和質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.3 A.Total RNA of the colon tissue；B，C.Amplification and identification ofβ-actin，CGRP and SP genes，respectively

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：各組數(shù)據(jù)結(jié)果以mean±SD表示。統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0軟件包，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸大體、顯微病理學(xué)變化

動(dòng)物于造模后24 h即出現(xiàn)懶動(dòng)，采食量明顯減少，體重較對(duì)照組明顯降低。黃色稀便，肛門(mén)周?chē)幻幌”阏慈?，最長(zhǎng)時(shí)可達(dá)兩周，有4只大鼠分別在灌腸后3～8日死亡。

在造模后第3、7天處死大鼠剖檢發(fā)現(xiàn)，整個(gè)結(jié)腸重量明顯增加，腸壁增厚、腸黏膜充血、水腫、糜爛、有潰瘍?cè)睿行┐笫笤谀c壁損傷部位有假膜樣物質(zhì)覆蓋，而且第7天最為嚴(yán)重（圖1A～F）。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖2A～F），灌藥后第3天腸絨毛出現(xiàn)脫落，出血和水腫，腸腔內(nèi)含有大量的壞死組織，腸腔擴(kuò)張，腸腺減少；第7天腸上皮壞死、脫落，黏膜層和固有層出現(xiàn)了大量炎性細(xì)胞和嚴(yán)重的水腫現(xiàn)象；第14天可以看到水腫和出血開(kāi)始逐漸消退，腸腺開(kāi)始新生，腸黏膜結(jié)構(gòu)開(kāi)始形成；第21天，腸上皮的杯狀細(xì)胞和隱窩開(kāi)始新生，而且還可以看出腸黏膜上皮是在壞死組織的基礎(chǔ)上開(kāi)始新生的；第28天出血和水腫完全消失，黏膜肌層結(jié)構(gòu)致密，在腸黏膜上有大量的杯狀細(xì)胞、發(fā)達(dá)的腸腺和隱窩形成（圖1，2見(jiàn)彩插7）。

2.2 SP、CGRP和β-actin基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

成功提取大鼠結(jié)腸組織的總RNA，電泳后可清晰看到28S、18S、5.8S三個(gè)條帶（圖3A）。以總RNA為模板，SP、CGRP和β-actin基因的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，分別獲得了117、140、147 bp的基因片段，與預(yù)期目的片段大小一致（圖3B）。分別將PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒的PCR鑒定（圖3C）。

2.3 樣品熒光定量PCR

通過(guò)Real-time RT-PCR方法檢測(cè)了SP、CGRP mRNA在IBD大鼠不同時(shí)期結(jié)腸組織中的表達(dá)變化（圖4）。SP和CGRP的mRNA水平在建模后逐漸升高，直到第7天達(dá)到最大值，然后隨著疾病的恢復(fù)而逐漸降低。

圖4 CGRP和SP在IBD大鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)變化（＊＊表示P＜0.01，差異極其顯著，*表示P＜0.05，差異顯著）Fig.4 Expression of CGRP and SP in the colonof IBD rats.（*P＜0.05，＊＊P＜0.01）

3 討論

IBD是一種在我國(guó)及歐美等諸多國(guó)家極為普遍的慢性胃腸道疾病，以腸道炎癥和腸黏膜損傷為主要特征，但至今其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為它是一種自身免疫性疾病，與遺傳、免疫、環(huán)境及黏膜屏障密切相關(guān)［1］。其中免疫因素在IBD發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。而神經(jīng)肽作為一種神經(jīng)調(diào)質(zhì)，不僅在神經(jīng)信息的傳導(dǎo)中起重要作用，也是炎癥反應(yīng)時(shí)激活神經(jīng)-免疫系統(tǒng)“對(duì)話(huà)”，誘發(fā)機(jī)體連鎖免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)［3］。

SP是一種發(fā)現(xiàn)最早、廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的具有多種生物活性的神經(jīng)肽（11肽）。外周組織器官內(nèi)的SP主要來(lái)源于器官內(nèi)辣椒素敏感神經(jīng)末稍，但大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)SP也可由淋巴細(xì)胞［4］、嗜酸粒細(xì)胞［5］、肥大細(xì)胞［6］和單核巨噬細(xì)胞［7］合成分泌，且這類(lèi)細(xì)胞表面還存在著SP的特異性受體NK1R。其生理作用為強(qiáng)烈促進(jìn)消化系統(tǒng)平滑肌收縮，刺激小腸、結(jié)腸黏膜分泌水和電解質(zhì)等。而降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種存在于感覺(jué)神經(jīng)末梢的神經(jīng)肽，由37個(gè)氨基酸組成，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在消化道中也大量存在。CGRP免疫反應(yīng)神經(jīng)纖維在腸肌層神經(jīng)叢有大量分布，在血管周?chē)?、黏膜、黏膜下層也有一些，在肌層中幾乎沒(méi)有。它可以對(duì)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制T細(xì)胞的增殖來(lái)降低巨噬細(xì)胞抗原提呈和活化淋巴細(xì)胞的功能［8］。比如，它可促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子［9］，也可促進(jìn)SP從初級(jí)傳入纖維末稍釋放并抑制中性?xún)?nèi)肽酶對(duì)SP的降解［10］。釋放出的SP可促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺、激肽、趨化因子、前列腺素、白三烯、IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ等大量炎癥介質(zhì)，可延緩中性粒細(xì)胞凋亡［11］，促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附和移行［12］，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附分子［13］，促進(jìn)肥大細(xì)胞表達(dá)TNF-α mRNA和分泌TNF-α［14］。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)采用TNBS化學(xué)誘導(dǎo)建立IBD大鼠模型，采用real-time RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)了CGRP和SP于不同時(shí)期的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)二者在結(jié)腸組織中的表達(dá)量均與疾病的發(fā)展程度呈正相關(guān)。與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸組織中的SP和CGRP均隨著疾病的發(fā)展而逐漸升高，直到第7天達(dá)到最大值，隨后逐漸減低，直到28 d接近于正常水平。已有研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）病人結(jié)腸黏膜SP含量明顯高于正常人，且結(jié)腸中P物質(zhì)神經(jīng)纖維比正常人神經(jīng)纖維線(xiàn)密度明顯增高，UC中腸道SP的升高與疾病的嚴(yán)重程度也是呈正相關(guān)的，亦即SP的水平可以間接反映疾病的嚴(yán)重程度［15，16］。近年來(lái)隨著對(duì)SP受體NKR研究的深入，發(fā)現(xiàn)NK-1R在UC病人結(jié)腸中的分布與正常人沒(méi)有明顯差異，都是分布在固有層單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、黏膜下血管平滑肌以及腸肌叢，但是UC病人結(jié)腸中NK-1R的含量卻明顯高于正常人［17-19］。Goode等［19］測(cè)得UC病人結(jié)腸組織中NK-1R的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平也都顯著高于正常結(jié)腸組織，推測(cè)過(guò)高的NK-1R表達(dá)于UC的發(fā)病有著重要關(guān)系。Lam rani A等［20］使用NK-1R拮抗劑用于由硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)能夠很好地降低實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸性的腸道炎癥反應(yīng)，NK-1R拮抗劑能夠降低能夠降低疾病活動(dòng)指數(shù)，降低MPO活性，他們發(fā)現(xiàn)NK-1R拮抗劑能夠減輕腸道氧化應(yīng)激，推測(cè)其與改善腸道炎癥有關(guān)，但具體作用機(jī)制還不是很清楚。Ioana等［21］將NK-1R拮抗劑LY303870用于由T細(xì)胞受體缺陷鼠IBD模型上，發(fā)現(xiàn)同樣能夠很好的改善腸道炎癥反應(yīng)。此外，Stucchi等［22］還發(fā)現(xiàn)SP參與了UC病人的隱窩炎，使用NK-1R拮抗劑后能明顯改善其臨床癥狀，同時(shí)降低組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性，暗示NK-1R拮抗劑對(duì)隱窩炎有著一定的治療價(jià)值，并有學(xué)者指出，在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中SP受體可能是一個(gè)潛在的治療目標(biāo)［23］。但也有研究者［19］發(fā)現(xiàn)，在嚴(yán)重UC患者腸道中SP含量是下降的，同時(shí)指出其機(jī)制可能與血管活性腸肽下降機(jī)制相類(lèi)似，與在疾病嚴(yán)重期造成的黏膜神經(jīng)受到很大破壞有關(guān)。

同樣，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中CGRP mRNA水平與大鼠IBD發(fā)病程度呈正相關(guān)。眾所周知，IBD是一種自身免疫性疾病，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡就會(huì)導(dǎo)致該疾病的發(fā)生。因此，當(dāng)IBD發(fā)生時(shí)，免疫失衡，同樣起著免疫調(diào)節(jié)作用的SP水平顯著升高時(shí)，相應(yīng)的CGRP也會(huì)隨著升高，使二者呈現(xiàn)平衡狀態(tài)。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過(guò)辣椒辣素、熱、酸誘導(dǎo)小鼠之后發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中CGRP釋放量顯著增加［24，25］。因此我們可以推斷，在IBD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，CGRP起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)促進(jìn)SP的釋放［9-14］。從而促進(jìn)相應(yīng)的免疫細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［25］。但也有學(xué)者在先后使用CGRP阻斷劑和CGRP抗體分別抑制內(nèi)源性和外源性CGRP后，發(fā)現(xiàn)UC模型的炎癥癥狀明顯加重，由此推斷感覺(jué)性神經(jīng)肽CGRP在UC中通過(guò)介導(dǎo)感覺(jué)神經(jīng)的保護(hù)效應(yīng)而減輕結(jié)腸黏膜炎癥反應(yīng)［26］。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠結(jié)腸SP和CGRP表達(dá)均較對(duì)照組顯著增加。已有學(xué)者證明在實(shí)驗(yàn)性慢性結(jié)腸炎癥大鼠脊髓中Fos、SP、CGRP表達(dá)均顯著增多［27］，這也就揭示了模型炎癥可能與外周初級(jí)傳入神經(jīng)元的損傷有關(guān)，而可能的機(jī)制是炎癥、化學(xué)物質(zhì)的刺激激活內(nèi)臟感受器，導(dǎo)致從腸道傳入脊髓的傷害性信號(hào)增多，通過(guò)釋放SP和CGRP等神經(jīng)遞質(zhì)作用于相應(yīng)的受體，從而導(dǎo)致疾病炎癥的加重。因此，我們可以推斷神經(jīng)遞質(zhì)SP和CGRP在IBD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮了重要的作用。

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