猴泡沫病毒間接免疫熒光檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

栗景蕊，賀爭(zhēng)鳴

（中國(guó)藥品生物制品檢定所，北京 100050）

免疫熒光技術(shù)在病毒領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，并且取得很大成就，主要用于病毒抗原在器官細(xì)胞內(nèi)的定位，病毒感染過(guò)程的研究，也可用來(lái)檢查血清中的抗病毒抗體［1］。猴群中猴泡沫病毒的自然感染率較高，檢測(cè)血清中抗體可以作為有效的篩查方法。由于間接免疫熒光法測(cè)定血清中抗體特異性和穩(wěn)定性較好，通過(guò)濃度梯度滴定，分別確定了一抗猴血清和二抗FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體的最佳工作濃度，建立了針對(duì)猴血清的間接免疫熒光方法（IFA）來(lái)檢測(cè)SFV，為保證猴源性生物材料使用的安全性打下了基礎(chǔ)。

用SFV病毒BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)的方法制備抗原，通過(guò)濃度梯度滴定，分別確定了一抗猴血清的最佳工作濃度和二抗FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體的最佳工作濃度。建立針對(duì)猴血清的間接免疫熒光方法（IFA），從而用以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用猴群中SFV的感染情況，根據(jù)熒光強(qiáng)度可以對(duì)猴血清抗體水平進(jìn)行半定量分析。

1 材料和方法

SFV-1株，購(gòu)自 ATCC，編號(hào)：VR-276。培養(yǎng)細(xì)胞為幼倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞（BHK-21），中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)室保存。

1.20.01 mol/L、pH 7.2的 PBS

1.3 FITC標(biāo)記的羊抗人 IgG抗體：KPL公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)中用1％伊文思蘭稀釋。

1.4 1％伊文思蘭：實(shí)驗(yàn)中用 0.01 mol/L、pH 7.2PBS作1∶10000稀釋。

1.5 猴血清標(biāo)本：采自國(guó)內(nèi)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)用恒河猴生產(chǎn)廠家。

1.6 猴SFVIgG抗體陽(yáng)性血清、陰性血清：為2008

年采集的血清標(biāo)本，并用ELISA方法鑒定。

導(dǎo)流洞封堵設(shè)計(jì)符合規(guī)范要求，封堵體布置合理，堵頭型式合適，堵頭長(zhǎng)度滿足穩(wěn)定要求。堵頭混凝土材料和灌漿設(shè)計(jì)合理，指標(biāo)合適。導(dǎo)流洞封堵方案合理，滿足工程蓄水要求。

1.7 SFV的細(xì)胞培養(yǎng)

將BHK-21細(xì)胞傳代培養(yǎng)，在傳代24 h之內(nèi)形成50～70％單層時(shí)接種SFV毒種1 m L。置37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附3 h，加入細(xì)胞維持液3 m L，置37℃的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。

1.8 制備抗原片

待接種 SFV病毒的 BHK-21細(xì)胞病變達(dá)到50％時(shí)，棄細(xì)胞液，用 PBS洗滌細(xì)胞表面一次，棄PBS。胰酶消化后，用PBS將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，收集于離心管內(nèi)。1000 rpm離心10 m in，棄上清，以適量PBS重懸細(xì)胞液。將重懸的細(xì)胞液滴于抗原片玻片孔中，使細(xì)胞鋪層面積達(dá)到50～80％。室溫晾干，至冷丙酮中于4℃固定15 m in，取出于蒸餾水中漂洗一遍，室溫晾干。同法設(shè)立正常BHK-21細(xì)胞對(duì)照。

1.9 SFV的間接免疫熒光染色

取細(xì)胞抗原片以PBS漂洗一次，室溫晾干。滴加用PBS梯度（1∶10，1∶20，1∶40）稀釋的血清樣品，置濕盒中，37℃保溫30 min。用 PBS漂洗三次，5 min/次，室溫晾干。滴加以1％伊文思蘭梯度（1∶100，1∶250，1∶500）稀釋的 FITC標(biāo)記的羊抗人 IgG抗體，37℃保溫30 min。用 PBS漂洗三次，5 min/次，室溫晾干。用50％的甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并確定一抗和二抗的最佳工作濃度。判斷標(biāo)準(zhǔn)，“—”無(wú)或可見微弱熒光；“+”可見的熒光；“++”可見有明亮的熒光；“+++”可見耀眼的熒光。

1.10 特異性檢測(cè)

用猴泡沫病毒抗原片、小鼠白血病病毒抗原片以及正常細(xì)胞片與最佳稀釋濃度的SFV抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性。

1.11 SFV抗體間接免疫熒光檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

應(yīng)用所建立的間接免疫熒光方法對(duì)采集的猴血清進(jìn)行檢測(cè)。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 一抗（血清）及二抗（FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體）最佳稀釋濃度的確定

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得：當(dāng)熒光抗體作1∶100稀釋時(shí)，特異性熒光最強(qiáng)，非特異性熒光最弱。1∶10，1∶20，1∶40稀釋的一抗均可見特異性熒光，其中1∶10可見陽(yáng)性細(xì)胞中清晰的熒光顆粒，熒光效果最好，所以，通過(guò)濃度梯度滴定，分別確定了一抗猴血清的最佳工作濃度為1∶10，二抗FITC標(biāo)記的羊抗人IgG抗體的最佳工作濃度為1∶100。IFA檢測(cè)方法抗體工作濃度滴定結(jié)果見表1。

表1 IFA檢測(cè)方法抗體工作濃度Tab.1 The concentration of antibody in IFA detection method

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果

用猴泡沫病毒抗原片、小鼠白血病病毒抗原片以及正常細(xì)胞片與最佳稀釋濃度血清進(jìn)行 IFA實(shí)驗(yàn)，猴泡沫病毒抗原片為陽(yáng)性，小鼠白血病病毒抗原片及正常細(xì)胞片均為陰性。這一結(jié)果表明，制備SFV抗原片用間接免疫熒光法檢測(cè)猴血清中 SFV IgG抗體特異性較好，檢測(cè)結(jié)果較可靠。

2.3 應(yīng)用所建立的間接免疫熒光方法對(duì)采集的猴血清進(jìn)行檢測(cè)

熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。見彩插4圖1，BHK-21細(xì)胞對(duì)照無(wú)熒光出現(xiàn)，也未觀察到熒光背景干擾。陽(yáng)性血清的IFA檢測(cè)可見綠色熒光，且細(xì)胞形態(tài)完整。在陽(yáng)性血清（3）圖中可見形成合胞體細(xì)胞，與SFV的致細(xì)胞病變效應(yīng)一致，SFV感染機(jī)體組織，可使細(xì)胞圓縮、脫落并伴合胞體形成。陰性血清的IFA檢測(cè)結(jié)果為紅色細(xì)胞，未見綠色熒光，為典型的IFA檢測(cè)陰性表現(xiàn)。34份猴血清檢測(cè)結(jié)果為：SFV抗體陽(yáng)性19例，陰性15例，與猴泡沫病毒在猴群中較高的感染率一致。同時(shí)說(shuō)明所建立的猴泡沫病毒抗體的間接免疫熒光檢測(cè)方法效果較好。

3 討論

猴泡沫病毒是靈長(zhǎng)類動(dòng)物特有的病毒，在猴群中自然感染率可達(dá)70％［2］，這些靈長(zhǎng)類動(dòng)物攜帶有SFV，但不會(huì)因感染而發(fā)病。SFV已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中常見的有干擾作用的病原體，已有報(bào)告證明我國(guó)猴群中SFV檢出率11.36％［3］，抗體陽(yáng)性率88.12％［3］。猴作為一種重要的模式動(dòng)物，應(yīng)用于多種疾病模型，也用于相關(guān)生物制品的生產(chǎn)，因此，進(jìn)一步完善對(duì)實(shí)驗(yàn)猴群的質(zhì)量監(jiān)控迫在眉睫。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒檢測(cè)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中，猴泡沫病毒是清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)排除的病原體。隨著對(duì) SFV研究的不斷深入，探索敏感性更高、特異性更好的檢測(cè)方法，對(duì)于保證實(shí)驗(yàn)猴群的質(zhì)量，控制SFV傳播和人民用藥安全具有深遠(yuǎn)意義。

猴泡沫病毒間接免疫熒光檢測(cè)方法是以猴血清中的IgG抗體為檢測(cè)對(duì)象，準(zhǔn)確度較好，特異性高，穩(wěn)定性好，非特異性熒光染色少。免疫熒光檢測(cè)方法與猴泡沫病毒的其它常規(guī)檢測(cè)方法如病毒的分離培養(yǎng)鑒定、全病毒ELISA法和RT-nestPCR相比，不僅取樣便捷，檢測(cè)效率也得到了大幅提高。應(yīng)用所建立的間接免疫熒光方法檢測(cè)SFV抗體時(shí)，取制備好的抗原片，每孔可檢測(cè)一份血清樣本，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)用猴的血樣進(jìn)行批量檢測(cè)。該檢測(cè)方法可用于對(duì)實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖單位進(jìn)行定期檢查，有利于保證實(shí)驗(yàn)用猴質(zhì)量，確保疫苗生產(chǎn)用生物材料的安全性。該檢測(cè)方法操作程序簡(jiǎn)單易用，并可進(jìn)一步制成檢測(cè)試劑盒，操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用。

SFV的血清學(xué)檢測(cè)方法中，有報(bào)道分別用兩種不同的 SFV 抗原：SFV（AGM）（african green monkey）和 SFV（CPZ）（chimpanzee）來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)SFV感染。這種方法程序復(fù)雜，且僅適合于極少數(shù)量非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的檢測(cè)。為使 SFV的血清學(xué)檢測(cè)更為便捷，Hussain［4］等人將來(lái)源于SFV（AGM）和SFV（CPZ）的抗原相結(jié)合再進(jìn)行 CA-WB（CPZAGM Westren blot）檢測(cè)，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。利用CA-WB還在曾經(jīng)認(rèn)為未受SFV感染的沼澤猴、長(zhǎng)臂猿等體內(nèi)檢測(cè)到SFV，說(shuō)明CA-WB具有較高的敏感性。國(guó)外還報(bào)道了一些檢測(cè)SFV的特殊技術(shù)，包括逆轉(zhuǎn)錄酶的測(cè)定、透射電子顯微術(shù)、免疫印跡法以及高敏感性的 PCR方法［5］。猴泡沫病毒在動(dòng)物體內(nèi)常呈隱性感染，在分析動(dòng)物SFV感染狀況和檢測(cè)生物制品 SFV污染時(shí)，為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，防止漏檢錯(cuò)檢，適當(dāng)?shù)穆?lián)合運(yùn)用各種檢測(cè)方法對(duì)SFV的綜合評(píng)估非常重要。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010版第三部，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.

［2］高一彤，曲京華，趙玫，等.靈長(zhǎng)類泡沫病毒的調(diào)查研究及現(xiàn)狀［J］.醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2006，22（3）：183-184.

［3］張永江.干擾生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物疾病［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2006，1（1）：60-62.

［4］Hussain AI，Shanmugam V，Bhullar VB，etal.Screening for simian foamy virus infection by using a combined antigen Western blot assay：evidence for a wide distribution among Old World primates and identification of four new divergent viruses［J］.Virology，2003，309（2）：248-257.

［5］Khan AS，Sears JF，Muller J，etal.Sensitive assays for isolation and detection of simian foamy retroviruses［J］.JClin Microbiol，1999，37（8）：2678-2686.