孔德強,李愛學,曾 林,趙彥斌,孫兆增,胡仲明
(北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心,北京 100071)
雌二醇對下丘腦-垂體-性腺軸具有雙向的調(diào)節(jié)作用。在卵泡生成的早期,中等水平的雌二醇就會抑制促卵泡生成素的釋放,發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)作用;但在發(fā)情前期,雌激素的突然上升會引起下丘腦/垂體促性腺激素釋放激素的迅速增高,發(fā)揮正反饋作用,從而引起動物的發(fā)情。目前對雌二醇在下丘腦/垂體性腺軸發(fā)揮正負兩種調(diào)節(jié)作用的機理還不清楚,對雌二醇作用的部位也不是很清楚。但越來越多的資料證實,雌二醇的正負反饋作用與受體在不同組織的表達差異、表達水平和表達時間密切相關(guān)[1-4]。
在大多數(shù)的哺乳動物,體內(nèi)都存在α和β兩種受體。哺乳動物的α和β兩種受體在下丘腦-垂體-性腺軸都廣泛存在,其中α受體是發(fā)現(xiàn)最早的一種受體。Kenney的實驗表明,雌二醇的α受體在負反饋作用中起主要的作用[5],但 Lindzey的實驗表明,雌二醇的α受體在正負反饋作用中都起作用[6]。β受體的發(fā)現(xiàn)相對較晚,對其功能的研究相對較少。僅有的一些資料證實,ERβ可調(diào)節(jié)個體的生殖過程,包括生殖器官的發(fā)育和生殖細胞的成熟,健康卵巢濾泡中ERβ高表達而ERα無表達,胎鼠或成年鼠睪丸中均有多種細胞表達ERβ。Hatoya的實驗證實,比格犬下丘腦、垂體和卵巢中 β受體的表達量在由間情期到發(fā)情期的轉(zhuǎn)變過程中,表達量逐漸上升,但α受體的變化趨勢并不明顯,提示ERβ在比格犬的生殖細胞的成熟過程中同樣發(fā)揮了重要的作用[7]。
我們前期的實驗證實,在比格犬的間情期末,雌二醇的正反饋作用對比格犬的發(fā)情具有重要的作用[8],并且Hatoya的實驗證實在比格犬的間情期末,雌二醇β受體的表達量變化明顯,推測雌二醇β受體可能在雌二醇的正反饋作用中發(fā)揮重要作用。但目前對比格犬雌二醇受體的信息了解較少,因此本研究擬初步研究雌二醇β受體的序列組成和結(jié)構(gòu),為深入研究其在雌二醇正反饋調(diào)節(jié)中作用奠定基礎。
1.1 材料
4只成年雌性比格犬,由本中心提供,實驗動物合格 證 號 [SCXK-(軍)2002-001]。Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-為TOYOBO公司產(chǎn)品;DEPC(Promega);凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(杭州BioFlux公司);LA -Taq,dNTP,Oligo(dT),pMD18-T克隆載體,Eco RⅠ內(nèi)切酶,Hin dⅢ為大連寶生物公司產(chǎn)品;E.coli DH5α感受態(tài)為北京博邁德公司產(chǎn)品。根據(jù)比格犬雌二醇受體β的基因序列設計兩對引物,分兩段擴增其全長基因:引物1:5'-aagagtttcctcagctgttgcc-3',引物 2:5'-gtcgaagatttccagaattcc-3',引物 3:5'-ggaattctggaaatcttcgac-3',引物 4:5'-aggcctgtttgcttcagactg-3'。
1.2 方法
1.2.1 比格犬下丘腦、垂體、卵巢和子宮總RNA的提取:
將RNA提取所用的剪刀、鑷子和玻璃棒等物品180℃干烤過夜;將玻璃用品用0.1%的DEPC水浸泡過夜,高壓后60℃烘干。選取4只比格犬新鮮的下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織20 mg,剪碎后放于5 m L的離心管中;將離心管置于液氮中充分冷卻,用玻璃板快速研磨;研磨充分后加入1 mL的 Trizol。按照Trizol使用說明書,提取不同組織的總RNA。
1.2.2 比格犬雌二醇 β受體的基因全長序列的獲得:
分別以提取的下丘腦、垂體、卵巢和子宮的總RNA為模版,以 olig(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物,進行反轉(zhuǎn)錄反應。反應條件為:42℃,1 h;95℃,5m in;4℃,5 m in。將下丘腦、垂體、卵巢和子宮的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合,以2μL混合的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版,利用 LATaq酶擴增比格犬雌二醇受體β的基因。利用引物1和2擴增比格犬雌二醇受體 β基因的前段序列(β上),利用引物3和4擴增比格犬雌二醇受體β基因的后段序列(β下)。反應條件都為:預變性95℃,4 min;30個循環(huán),95℃ 30 s,52℃40 s,72℃ 2 min;最后72℃延伸7 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果,并用凝膠回收試劑盒回收基因片段。
1.2.3 比格犬雌二醇 β受體基因的克隆測序和序列比較:
將回收后的基因片段連接到pMD18-T克隆載體,并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞。利用PCR和Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切結(jié)合的方法篩選陽性重組子,將陽性克隆進行測序,每段基因選擇兩個陽性克隆,分別雙向測序。利用DNAMAN軟件編輯測序序列,并與比格犬的基因序列進行同源性分析。
2.1 比格犬下丘腦、垂體、卵巢和子宮總 RNA的提取結(jié)果
成功的從四只比格犬的下丘腦、卵巢和子宮中提取的總RNA,但垂體的總RNA提取都沒有成功,結(jié)果見圖1。
2.2 比格犬雌二醇受體β上基因片段和β下基因片段
圖1 總RNA的提取結(jié)果Fig.1 The results of total RNA extraction
以下丘腦、卵巢和子宮的混合反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,利用引物1和2,成功的擴增到比格犬雌二醇受體β上基因片段,其主要條帶的長度約為1100 bp;利用引物3和4,成功的擴增到雌二醇受體β下基因片段,其主要條帶的長度約為1000 bp,四只比格犬的擴增結(jié)果相同,結(jié)果見圖2和圖3。
2.3 比格犬雌二醇受體β上基因片段和β下基因片段的克隆
圖2 雌二醇受體β基因前段序列的擴增結(jié)果注:1為100 bp ladder分子量標準,2,3,4和5為陽性擴增)Fig.2 The amplification results of anterior segmentof estrogen receptorβ
利用PCR和雙酶切的方法,分別篩選出攜帶β上基因片段和 β下基因片段的陽性重組質(zhì)粒,見圖4。
圖3 雌二醇受體β基因后段序列的擴增結(jié)果注:2為100 bp ladder分子量標準,1,2,3,和4為陽性擴增)Fig.3 The amplification results of anterior segmentof estrogen receptorβNote:1 representmolecular standard of 100 bp ladder,2,3,4,5 represents positive results
圖4 pMD18-T-β上和pMD18-T-β下的酶切和PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of recombinant plasmid ofpMD18-T-β上and pMD18-T-β下
2.4 比格犬雌二醇受體β上基因片段和β下基因片段的測序結(jié)果
測序結(jié)果表明,比格犬雌二醇受體 β上基因片段的全長為1166 bp,β下基因片段的全長為1024 bp。將兩段序列進行拼接,并利用DNAMAN軟件分析,其編碼框序列為1509 bp,與NCBI數(shù)據(jù)庫預測的10種剪切異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)都不相同,可能為一種新的剪切異構(gòu)體。1509 bp的編碼序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因組序列相比,共有5處發(fā)生了突變,分別為479處由A→G,導致組氨酸突變?yōu)榫彼幔?05處由T→C,導致半胱氨酸突變?yōu)榫彼幔?29處由A→G,導致異亮氨酸突變?yōu)轭R氨酸;624處由A→G,該突變沒有導致氨基酸突變,1031處T→C,導致蛋氨酸突變?yōu)樘K氨酸。
比格犬雌二醇β受體可能在雌二醇的正反饋作用中發(fā)揮重要作用,但目前對該受體結(jié)構(gòu)和功能的信息了解較少。人ERβ可以分成ERβ1~5五個異構(gòu)型,大鼠的ERβ有三種異構(gòu)型,而小鼠的ERβ有兩種異構(gòu)型[9,10]。NCBI數(shù)據(jù)庫根據(jù)家犬的基因組序列和人的雌二醇受體的剪切異構(gòu)體信息推測,犬的雌二醇β受體可能存在多種剪切異構(gòu)體。因此本試驗利用兩對特異性引物,擬對比格犬雌二醇受體下丘腦、垂體、子宮和卵巢內(nèi)可能存在的剪切異構(gòu)體進行了克隆和序列分析。
對下丘腦、子宮和卵巢內(nèi)比格犬雌二醇受體的擴增克隆結(jié)果表明,雌二醇受體存在一種主要的剪切異構(gòu)體,其分子量的大小與NCBI數(shù)據(jù)庫的預測不同,但測序結(jié)果證實這是比格犬雌二醇受體的一種新的剪切異構(gòu)體。
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