一種比格犬雌二醇β受體剪切異構(gòu)體的克隆和序列分析

孔德強(qiáng)，李愛學(xué)，曾 林，趙彥斌，孫兆增，胡仲明

（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100071）

雌二醇對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸具有雙向的調(diào)節(jié)作用。在卵泡生成的早期，中等水平的雌二醇就會(huì)抑制促卵泡生成素的釋放，發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用；但在發(fā)情前期，雌激素的突然上升會(huì)引起下丘腦/垂體促性腺激素釋放激素的迅速增高，發(fā)揮正反饋?zhàn)饔?，從而引起?dòng)物的發(fā)情。目前對(duì)雌二醇在下丘腦/垂體性腺軸發(fā)揮正負(fù)兩種調(diào)節(jié)作用的機(jī)理還不清楚，對(duì)雌二醇作用的部位也不是很清楚。但越來越多的資料證實(shí)，雌二醇的正負(fù)反饋?zhàn)饔门c受體在不同組織的表達(dá)差異、表達(dá)水平和表達(dá)時(shí)間密切相關(guān)［1-4］。

在大多數(shù)的哺乳動(dòng)物，體內(nèi)都存在α和β兩種受體。哺乳動(dòng)物的α和β兩種受體在下丘腦-垂體-性腺軸都廣泛存在，其中α受體是發(fā)現(xiàn)最早的一種受體。Kenney的實(shí)驗(yàn)表明，雌二醇的α受體在負(fù)反饋?zhàn)饔弥衅鹬饕淖饔茫?］，但 Lindzey的實(shí)驗(yàn)表明，雌二醇的α受體在正負(fù)反饋?zhàn)饔弥卸计鹱饔茫?］。β受體的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，對(duì)其功能的研究相對(duì)較少。僅有的一些資料證實(shí)，ERβ可調(diào)節(jié)個(gè)體的生殖過程，包括生殖器官的發(fā)育和生殖細(xì)胞的成熟，健康卵巢濾泡中ERβ高表達(dá)而ERα無表達(dá)，胎鼠或成年鼠睪丸中均有多種細(xì)胞表達(dá)ERβ。Hatoya的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，比格犬下丘腦、垂體和卵巢中 β受體的表達(dá)量在由間情期到發(fā)情期的轉(zhuǎn)變過程中，表達(dá)量逐漸上升，但α受體的變化趨勢(shì)并不明顯，提示ERβ在比格犬的生殖細(xì)胞的成熟過程中同樣發(fā)揮了重要的作用［7］。

我們前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在比格犬的間情期末，雌二醇的正反饋?zhàn)饔脤?duì)比格犬的發(fā)情具有重要的作用［8］，并且Hatoya的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在比格犬的間情期末，雌二醇β受體的表達(dá)量變化明顯，推測(cè)雌二醇β受體可能在雌二醇的正反饋?zhàn)饔弥邪l(fā)揮重要作用。但目前對(duì)比格犬雌二醇受體的信息了解較少，因此本研究擬初步研究雌二醇β受體的序列組成和結(jié)構(gòu)，為深入研究其在雌二醇正反饋調(diào)節(jié)中作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

4只成年雌性比格犬，由本中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格 證 號(hào) ［SCXK-（軍）2002-001］。Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-為TOYOBO公司產(chǎn)品；DEPC（Promega）；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（杭州BioFlux公司）；LA -Taq，dNTP，Oligo（dT），pMD18-T克隆載體，Eco RⅠ內(nèi)切酶，Hin dⅢ為大連寶生物公司產(chǎn)品；E.coli DH5α感受態(tài)為北京博邁德公司產(chǎn)品。根據(jù)比格犬雌二醇受體β的基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分兩段擴(kuò)增其全長基因：引物1：5＇-aagagtttcctcagctgttgcc-3＇，引物 2：5＇-gtcgaagatttccagaattcc-3＇，引物 3：5＇-ggaattctggaaatcttcgac-3＇，引物 4：5＇-aggcctgtttgcttcagactg-3＇。

1.2 方法

1.2.1 比格犬下丘腦、垂體、卵巢和子宮總RNA的提?。?/p>

將RNA提取所用的剪刀、鑷子和玻璃棒等物品180℃干烤過夜；將玻璃用品用0.1％的DEPC水浸泡過夜，高壓后60℃烘干。選取4只比格犬新鮮的下丘腦、垂體、卵巢和子宮組織20 mg，剪碎后放于5 m L的離心管中；將離心管置于液氮中充分冷卻，用玻璃板快速研磨；研磨充分后加入1 mL的 Trizol。按照Trizol使用說明書，提取不同組織的總RNA。

1.2.2 比格犬雌二醇 β受體的基因全長序列的獲得：

分別以提取的下丘腦、垂體、卵巢和子宮的總RNA為模版，以 olig（dT）為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：42℃，1 h；95℃，5m in；4℃，5 m in。將下丘腦、垂體、卵巢和子宮的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合，以2μL混合的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，利用 LATaq酶擴(kuò)增比格犬雌二醇受體β的基因。利用引物1和2擴(kuò)增比格犬雌二醇受體 β基因的前段序列（β上），利用引物3和4擴(kuò)增比格犬雌二醇受體β基因的后段序列（β下）。反應(yīng)條件都為：預(yù)變性95℃，4 min；30個(gè)循環(huán)，95℃ 30 s，52℃40 s，72℃ 2 min；最后72℃延伸7 min。利用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并用凝膠回收試劑盒回收基因片段。

1.2.3 比格犬雌二醇 β受體基因的克隆測(cè)序和序列比較：

將回收后的基因片段連接到pMD18-T克隆載體，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。利用PCR和Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切結(jié)合的方法篩選陽性重組子，將陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，每段基因選擇兩個(gè)陽性克隆，分別雙向測(cè)序。利用DNAMAN軟件編輯測(cè)序序列，并與比格犬的基因序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 比格犬下丘腦、垂體、卵巢和子宮總 RNA的提取結(jié)果

成功的從四只比格犬的下丘腦、卵巢和子宮中提取的總RNA，但垂體的總RNA提取都沒有成功，結(jié)果見圖1。

2.2 比格犬雌二醇受體β上基因片段和β下基因片段

圖1 總RNA的提取結(jié)果Fig.1 The results of total RNA extraction

以下丘腦、卵巢和子宮的混合反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用引物1和2，成功的擴(kuò)增到比格犬雌二醇受體β上基因片段，其主要條帶的長度約為1100 bp；利用引物3和4，成功的擴(kuò)增到雌二醇受體β下基因片段，其主要條帶的長度約為1000 bp，四只比格犬的擴(kuò)增結(jié)果相同，結(jié)果見圖2和圖3。

2.3 比格犬雌二醇受體β上基因片段和β下基因片段的克隆

圖2 雌二醇受體β基因前段序列的擴(kuò)增結(jié)果注：1為100 bp ladder分子量標(biāo)準(zhǔn)，2，3，4和5為陽性擴(kuò)增）Fig.2 The amplification results of anterior segmentof estrogen receptorβ

利用PCR和雙酶切的方法，分別篩選出攜帶β上基因片段和 β下基因片段的陽性重組質(zhì)粒，見圖4。

圖3 雌二醇受體β基因后段序列的擴(kuò)增結(jié)果注：2為100 bp ladder分子量標(biāo)準(zhǔn)，1，2，3，和4為陽性擴(kuò)增）Fig.3 The amplification results of anterior segmentof estrogen receptorβNote：1 representmolecular standard of 100 bp ladder，2，3，4，5 represents positive results

圖4 pMD18-T-β上和pMD18-T-β下的酶切和PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of recombinant plasmid ofpMD18-T-β上and pMD18-T-β下

2.4 比格犬雌二醇受體β上基因片段和β下基因片段的測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明，比格犬雌二醇受體 β上基因片段的全長為1166 bp，β下基因片段的全長為1024 bp。將兩段序列進(jìn)行拼接，并利用DNAMAN軟件分析，其編碼框序列為1509 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的10種剪切異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)都不相同，可能為一種新的剪切異構(gòu)體。1509 bp的編碼序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因組序列相比，共有5處發(fā)生了突變，分別為479處由A→G，導(dǎo)致組氨酸突變?yōu)榫彼幔?05處由T→C，導(dǎo)致半胱氨酸突變?yōu)榫彼幔?29處由A→G，導(dǎo)致異亮氨酸突變?yōu)轭R氨酸；624處由A→G，該突變沒有導(dǎo)致氨基酸突變，1031處T→C，導(dǎo)致蛋氨酸突變?yōu)樘K氨酸。

3 討論

比格犬雌二醇β受體可能在雌二醇的正反饋?zhàn)饔弥邪l(fā)揮重要作用，但目前對(duì)該受體結(jié)構(gòu)和功能的信息了解較少。人ERβ可以分成ERβ1～5五個(gè)異構(gòu)型，大鼠的ERβ有三種異構(gòu)型，而小鼠的ERβ有兩種異構(gòu)型［9，10］。NCBI數(shù)據(jù)庫根據(jù)家犬的基因組序列和人的雌二醇受體的剪切異構(gòu)體信息推測(cè)，犬的雌二醇β受體可能存在多種剪切異構(gòu)體。因此本試驗(yàn)利用兩對(duì)特異性引物，擬對(duì)比格犬雌二醇受體下丘腦、垂體、子宮和卵巢內(nèi)可能存在的剪切異構(gòu)體進(jìn)行了克隆和序列分析。

對(duì)下丘腦、子宮和卵巢內(nèi)比格犬雌二醇受體的擴(kuò)增克隆結(jié)果表明，雌二醇受體存在一種主要的剪切異構(gòu)體，其分子量的大小與NCBI數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)不同，但測(cè)序結(jié)果證實(shí)這是比格犬雌二醇受體的一種新的剪切異構(gòu)體。

［1］Ordog T，Goldsmith JR，Chen MD，et al.On the Mechanism of the Positive Feedback Action of Estradiol on Luteinizing Hormone Secretion in the Rhesus Monkey［J］.Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，1998，83（11）：4047-4053.

［2］Kinoshita M，Tsukamura H，Adachi S，et al.Involvement of Central Metastin in the Regulation of Preovulatory Luteinizing Hormone Surge and Estrous Cyclicity in Female Rats［J］.Endocrinology，2008，146（10）：4431-4436.

［3］Messinis IE.Ovarian feedback，mechanism of action and possible clinical implications［J］.Human Reproduction Update，2006，12（5）：557-571.

［4］K lein R，Schams D，F(xiàn)ailing K and Hoffmann B.Investigations on the Re-establishment of the Positive Feedback of Oestradiol during Anoestrus in the Bitch［J］.Reprod Dom Anim，2003，38：13-20.

［5］Kenney CG，Hurley LA，Pfaff L，et al.Nonclassical estrogen receptorαsignaling mediates negative feedback in the female mouse reproductive axis［J］.PNAS，2007，104（19）：8173 -8177.

［6］Lindzey J，Jayes FL，Yates MM，et al.The bi-modal effects of estradiol on gonadotropin synthesis and secretion in female mice are dependent on estrogen receptor-α［J］. Journal of Endocrinology（2006）191，309-317.

［7］Hatoya S，Torii R，Kumagai D，et al.Expression of estrogen receptorαandβgenes in the mediobasal hypothalamus，pituitary and ovary during the canine estrous cycle［J］.Neuroscience Letters，2003，347：131-135

［8］孫兆增，曾林，洪寶慶等.乙烯雌酚對(duì)間情期比格犬發(fā)情的誘導(dǎo)［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（11）：36-38.

［9］Moore JT，McKee DD，Slentz-Kesler K，et al.Cloning and characterisation of human estrogen receptorβ isoforms［J］.ΒiochemΒiophys Res Commun 1998；247：75-8.

［10］Leung Y-K，MakP，HassanS，etal.Estrogen receptor（ER）-βisoforms：a key to understanding ER-βsignaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA 2006；103：13162-7.