獼猴脫毛的營養(yǎng)學(xué)因素分析

魯帥堯，和占龍，陳麗雄，趙 遠(yuǎn)，禹文海，王俊斌，楊鳳梅

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118）

獼猴（Macaca malutta）是國家二級保護(hù)動物，人 工飼養(yǎng)繁殖已有50多年歷史。人工飼養(yǎng)繁殖的實驗獼猴遺傳背景清楚、生理生化指標(biāo)穩(wěn)定，在生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，同時也是研究人類健康和疾病的理想動物模型。隨著生物醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展和靈長類動物在該領(lǐng)域研究中應(yīng)用的特殊意義，獼猴資源日趨顯得極為珍貴。由于野生資源有限，人工飼養(yǎng)繁殖是各研究領(lǐng)域獲得實驗獼猴的重要手段，但是獼猴在人工繁殖中由于對其營養(yǎng)學(xué)的研究不夠深入，還存在很多與營養(yǎng)相關(guān)的問題有待解決［1］。在冬春季節(jié)脫毛現(xiàn)象較為普遍，不僅影響了的外觀，也使獼猴自身的健康造成損害，嚴(yán)重影響了動物質(zhì)量。根據(jù)文獻(xiàn)資料表明，獼猴脫毛因素有多種，甚至是多種因素共同作用結(jié)果，如皮膚真菌、寄生蟲、健康狀況、營養(yǎng)、動物本身的激素水平等。依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報道及本單位猴群的具體脫毛情況，我們在排除了寄生蟲等因素后，對獼猴脫毛展開了相關(guān)營養(yǎng)學(xué)指標(biāo)的測定與分析。［2-4］

礦物元素是動物機體生長發(fā)育和物質(zhì)代謝等生命過程不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，其中的微量元素雖在體內(nèi)含量甚微，卻具有調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)，促進(jìn)常量元素在體內(nèi)轉(zhuǎn)運，參與合成及構(gòu)成某些營養(yǎng)素等多種生物學(xué)功能［5］。被毛是動物排泄金屬離子的器官之一，被毛中微量元素的含量能較敏感、穩(wěn)定地反映體內(nèi)元素水平，測定動物體內(nèi)的微量元素含量對了解動物的生長發(fā)育及營養(yǎng)狀況具有重要的指導(dǎo)意義［6］。被毛中的氨基酸主要以角蛋白的形式存在，屬于不溶性蛋白質(zhì)，具有特殊的結(jié)構(gòu)，呈纖維狀、穩(wěn)定性高、彈性好、膨脹性小，經(jīng)水解可以得到18種天然氨基酸［7］。根據(jù) W.G.Crewthr的研究，高硫蛋白質(zhì)富寓于羊毛纖維的胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸中，這些氨基酸主要構(gòu)成纖維中的基質(zhì)，沒有α-螺旋結(jié)構(gòu)；低硫蛋白質(zhì)富寓于谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸中，并主要構(gòu)成纖維中基原纖，有50％左右的α-螺旋結(jié)構(gòu)，有利于毛纖維的高結(jié)晶度和增大強力［8］。因此，根據(jù)獼猴人工養(yǎng)殖普遍存在的被毛質(zhì)量問題［2］，結(jié)合野外猴被毛質(zhì)量較好的特點，本研究對具有不同被毛品質(zhì)的獼猴的被毛進(jìn)行了6種微量元素和18種氨基酸含量的測定，同時測定其血清中的8種礦物元素，評定脫毛獼猴與具有不同被毛品質(zhì)獼猴的礦物元素和氨基酸的營養(yǎng)狀況，以便于從調(diào)整飼料營養(yǎng)素水平方式，來改善和提高人工養(yǎng)殖獼猴被毛質(zhì)量及其實驗動物質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所［SCXK （滇）2010-0006）］和普洱市提供，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 儀器設(shè)備

原子吸收分光光度計（德國V6），原子熒光光度計（AFS-930），日立L8800氨基酸自動分析儀（日本日立公司），高速離心機，全自動生化分析儀（Olympus Au5400）。

1.3 方法

1.3.1 分組：選擇具有不同被毛品質(zhì)的成年獼猴共30只，雌雄隨機搭配。分為 A、B、C三組，每組10只，其中A組是從飼養(yǎng)場隨機挑選的脫毛猴，按本場的獼猴飲食制度和營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，被毛脫落、稀疏且光澤度差；B組是從半自然圈養(yǎng)環(huán)境（猴園）中隨機挑選的，自由采食本場營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的飼料，被毛覆蓋良好但光澤度差；C組是來自云南省普洱市鎮(zhèn)源縣的野生猴，自由采食野外食物，被毛覆蓋很好且光澤度很好。

1.3.2 取樣

1.3.2.1 用毛剪取試驗猴頭部、背部、腹部、四肢和尾部被毛，每只采集樣品量為30 g；充分混勻后用洗潔精清洗，再用清水漂洗干凈，自然風(fēng)干，裝樣品袋封存待用。

1.3.2.2 后肢靜脈采血3 m L，制備血清，-20℃冰箱保存，備用。

1.3.3 被毛樣品處理

1.3.3.1 微量元素測定：稱取3 g猴毛樣品，置于瓷坩堝中緩慢加熱至炭化，在 500℃高溫下加熱5 h。直至樣呈灰白色。冷卻，用少量水潤濕，然后加5 m L硝酸（1+1），3 m L鹽酸（1+1），在120℃電熱板上加熱，待消解液剩1/3時，把溶液轉(zhuǎn)入50 m L容量瓶中，同時加入 5 m L（50 g/L）硫尿、5 mL （50 g/L）抗壞血酸，然后用蒸溜水定容至刻度，靜止30 min后，用中速濾紙過濾。濾液分別用原子吸收分光光度計和原子熒光光度計測定其微量元素含量。

1.3.3.2 氨基酸測定：采用毛發(fā)水解法水解被毛角蛋白。先稱取含蛋白7.5～25 mg的試樣（約50～100 mg，準(zhǔn)確至 0.1 mg）于 20 m L安瓿中，加10.00 mL酸解劑（6 mol/L鹽酸溶液），置液氮或干冰（丙酮）中冷卻，然后抽真空至7 Pa（≤5×10-2mmHg）后封口。將水解管放在110℃恒溫干燥箱中，水解22～24 h，之后冷卻、混勻、開管、過濾，用移液管吸取適量的濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或濃縮器中，保持60℃抽真空蒸發(fā)至干，必要時加少許水重復(fù)蒸干1～2次；加入3～5 mL pH值2.2的檸檬酸鈉緩沖液，使樣品液中氨基酸濃度達(dá)50～250 nmol/m L，搖勻、過濾或離心取上清液，即可上機測定。

1.3.4 分析項目及檢測方法：

1.3.4.1 用原子吸收分光光度計測定被毛中銅（Cu）、鐵（Fe）、錳（Mn）、鋅（Zn）；用原子熒光光度計測定鉛（Pb）、砷（As）。

1.3.4.2 被毛氨基酸測定項目有，天門冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Gystine）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、氨（NH3）。氨基酸分析儀的主要色譜條件和技術(shù)指標(biāo)，進(jìn)樣量為20μL，分離柱（離子交換柱）溫度為50℃，反應(yīng)柱溫度為130℃；定量測定重現(xiàn)性變異系數(shù)CV值≤1％。

1.3.4.3 血清中K、Na、Cl采用間接離子選擇電極法，Ca采用OCPC法，P采用直接紫外法，Mg采用絡(luò)合指示劑法，F(xiàn)e采用亞鐵嗪法，Cu采用原子吸收光譜法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析［9］。

2 結(jié)果

2.1 被毛微量元素的測定和分析結(jié)果

三組試驗獼猴被毛中6種微量元素的測定及分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明，A組、B組和C組試驗猴被毛的Cu、Fe含量分別為12.45 mg/kg、11.90 mg/ kg、12.70 mg/kg和 40.80 mg/kg、55.20 mg/kg、48.70 mg/kg，Mn的含量分別為3.29 mg/kg、3.41 mg/kg、0.63 mg/kg，Zn的含量分別為 136.00 mg/ kg、123.00 mg/kg、149.00 mg/kg，Pb的含量分別為2.34 mg/kg、4.98 mg/kg、1.32 mg/kg，As的含量分別為0.02 mg/kg、0.03 mg/kg、0.01 mg/kg。各組試驗猴被毛Cu、Fe含量無顯著性差異（P＞0.05），但Mn、Zn、Pb、As則均有極顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 被毛氨基酸含量測定和分析結(jié)果

三組試驗獼猴被毛的氨基酸含量測定分析的結(jié)果見表2。結(jié)果為被毛脯氨酸、纈氨酸、氨和精氨酸的含量A組和B組極顯著低于C組（P＜0.01），而A組與B組間無顯著性差異（P＞0.05）；C組被毛胱氨酸含量高于A組2.06％（P＜0.01）和高于B組4.44％（P＜0.01）。被毛酪氨酸含量則是 A顯著低于B組（P＜0.05），且極顯著低于 C組（P＜0.01），B組又顯著低于 C組（P＜0.05）；被毛苯丙氨酸含量是B組高于C組（P＜0.05），且高于A組（P＜0.01），C組又高于A組（P＜0.05）；被毛賴氨酸、組氨酸和氨基酸總量含量是C組高于A組（P＜0.05）和高于 B組（P＜0.01），A組高于B組（P＜0.05）。其余氨基酸均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 血清礦物元素測定和分析結(jié)果

血清礦物元素的檢測及分析結(jié)果見表3。從表3可以看出，A、B組的Mg、P、Cu和Ca的含量高于C組，其余礦物元素的含量基本一致。經(jīng)統(tǒng)計分析表明，A組和B組Mg、P和Cu的含量與C組差異顯著（P＜0.01），而A組與B組差異不顯著（P＞0.05）； A組中Ca的含量與C組差異顯著（P＜0.01），但B組與A組和C組均無顯著性差異（P＞0.05）；血清K、Na、Cl、Fe的含量在各組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同被毛品質(zhì)獼猴被毛微量元素含量（mg/kg）Tab.1 The contents of trace elements in different quality hair of Macaca mulatta（mg/kg）

表3 不同被毛品質(zhì)獼猴血清中礦物元素含量的測定結(jié)果Tab.3 The content of trace elements in Serum of Macaca mulatta of different quality hair

3 討論

3.1 微量元素與被毛質(zhì)量的分析

不同品質(zhì)的獼猴被毛微量元素 Cu和 Fe含量無顯著性差異（P＞0.05），但是被毛Cu的含量是C組高于A組和B組，F(xiàn)e的含量則是B組高于C組和A組。Cu是動物體內(nèi)賴氨酸氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、單胺氧化酶等30多種酶的活性成分，參與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)和造血過程；Fe參與血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化物酶、觸酶合成等［10］。因此，結(jié)合分析結(jié)果可以看出，Cu和 Fe應(yīng)該不是影響人工飼養(yǎng)猴被毛質(zhì)量的主要微量元素。被毛Mn含量的測定結(jié)果是A組和B組高于C組（P＜0.01），但 A組和 B組之間無顯著差異（P＞0.05）。Mn是丙酮酸氧化酶、超氧化物歧化酶、精氨酸酶等的組成成分，對動物的生長發(fā)育、繁殖和內(nèi)分泌有影響［11］，過量易蓄積于睪丸組織并造成一系列毒性作用［12-14］。從不同被毛品質(zhì)分組的試驗猴被毛Mn的含量分析，被毛質(zhì)量優(yōu)的野外猴被毛Mn的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人工飼養(yǎng)猴（P＜0.01），這與高云芳等［15］在川金絲猴上的研究結(jié)果是一致的。因此，環(huán)境或飼料中Mn超標(biāo)應(yīng)該是造成人工飼養(yǎng)獼猴被毛Mn含量較高的原因，實踐經(jīng)驗也表明飼料中不添加Mn制劑對人工飼養(yǎng)獼猴的被毛有一定的改善作用，所以Mn過量很可能是影響獼猴被毛質(zhì)量的因素之一。被毛Zn的含量分析結(jié)果是C組高于A組、A組高于 B組，并有極顯著性差異（P＜0.01）。Zn是微量元素中研究得比較充分的微量元素，臨床上Zn缺乏主要表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、食欲減退、傷口愈合緩慢、性功能障礙、夜盲癥、脫發(fā)等［16］。結(jié)果顯示，人工飼養(yǎng)猴被毛 Zn的含量低于野外猴，因此Zn的供給不足也應(yīng)該是影響人工飼養(yǎng)獼猴被毛質(zhì)量的因素。被毛重金屬Pb和As的含量是B組高于A組、A組高于C組（P＜0.01）。從Pb在被毛中的沉積可以看出，人工飼養(yǎng)猴的環(huán)境或飼料中Pb的含量高于野外猴，雖然在飼養(yǎng)中未有Pb中毒現(xiàn)象，但與野外猴相比它們在猴毛中大量沉積。因此，控制飼料中 Pb的含量應(yīng)該是提高獼猴被毛質(zhì)量的一個有效手段。被毛As的含量雖然人工飼養(yǎng)猴高于野外猴（P＜0.01），但As參與蛋白質(zhì)的代謝；影響血清堿性磷酸酶、γ一谷氨酸轉(zhuǎn)移肽酶的活性；刺激造血器官，小劑量時能使骨骼造血機能活躍，促使紅細(xì)胞和血色素新生，改善皮膚營養(yǎng)和毛色，興奮神經(jīng)系統(tǒng)，大劑量時則抑制造血器官；可防止硒中毒，還是碘、汞、鉛的頡頏劑［17］。就 As特殊的營養(yǎng)作用，在人工飼養(yǎng)獼猴中的應(yīng)用還有待作進(jìn)一步研究。

3.2 氨基酸與被毛質(zhì)量的分析

由于采用酸水解被毛角蛋白方法進(jìn)行處理，色氨酸被破壞不能進(jìn)行測定，色氨酸的含量將以氨的形式大概得以體現(xiàn)，因為水解過程中對氨基酸的破壞主要以色氨酸為主。被毛 NH3的含量為 A組2.08％、B組2.1％、C組1.36％，這表明本次試驗的野外猴組被毛氨基酸的抗水解能力最強，說明野外猴的被毛在保持優(yōu)良光澤的性能方面優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴［18］，這符合野外猴被毛光澤度優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴的實際情況。實驗結(jié)果表明，不同品質(zhì)獼猴被毛氨基酸含量有一半以上存在差異。其中被毛脯氨酸、纈氨酸、氨和精氨酸的含量是人工飼養(yǎng)猴（包括A組和B組）低于野外猴組（C組）（P＜0.01），提示在人工飼養(yǎng)猴的食物組成中脯氨酸、纈氨酸、氨（色氨酸）和精氨酸可能不足；被毛胱氨酸的含量也是A組、B組極顯著低于C組（P＜0.01），但B組又極顯著低于A組（P＜0.01）；被毛賴氨酸、組氨酸和氨基酸總量含量是C組顯著高于A組（P＜0.05）和極顯著高于B組（P＜0.01）。根據(jù)此結(jié)果推測，影響獼猴被毛相應(yīng)氨酸含量的因素不僅是食物相應(yīng)氨酸的含量，生活環(huán)境也有很大的影響；其余的氨基酸含量基本一致。分析結(jié)果表明，C組被毛胱氨酸含量高于A組2.06％（P＜0.01）和高于B組4.44％ （P＜0.01）。胱氨酸對毛纖維的彈性和強力有一定影響，通常其含量越高毛纖維的彈性和強力也越大［8］。因此，這個結(jié)果既證明了以上胱氨酸對被毛的影響作用的理論，也符合野外猴被毛的彈性和強力等質(zhì)量優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴的實際。因此，可以推測胱氨酸對改善獼猴被毛品質(zhì)、提高被毛質(zhì)量應(yīng)該有一定作用。對獼猴被毛進(jìn)行含硫氨基酸的分析。高硫氨基酸包括胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和色氨酸；低硫氨基酸包括谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸。結(jié)果表明，獼猴被毛的高硫和低硫氨基酸總含量分別為 A組29.14％和35.9％、B組26.22％和36.7％、C組30.92％和36.65％，從而也可以推測C組野外猴被毛的纖維結(jié)晶度較高、強力大、初始模量較大［8］，說明野外猴被毛的光澤、品質(zhì)以及抗脫毛能力等均優(yōu)于人工飼養(yǎng)猴。

3.3 血清礦物元素與被毛質(zhì)量的分析

各組試驗獼猴血清中礦物元素K、Na、Cl和Fe的含量均無顯著性差異，說明這些礦物元素的供給和利用在三個試驗組中是相對一致的。但 Fe含量的測定分析結(jié)果與黃妙輝等［19］的結(jié)果有所差異。C組血清礦物元素中Mg和P含量極顯著低于A組和B組（P＜0.01）；Ca含量也顯著低于 A組（P＜0.05），而與B組無顯著差異（P＞0.05）。微量元素Cu則A組和B組極顯著高于C組（P＜0.01）。引起其顯著差異原因除了食物中礦物元素的含量有差異外，動物處于不同生存環(huán)境下對營養(yǎng)成分的需求和利用也是影響其差異的重要原因。根據(jù)測定結(jié)果推測，高營養(yǎng)水平的Ca、Mg、P和Cu可能會影響人工飼養(yǎng)的獼猴的被毛質(zhì)量。

本次對人工飼養(yǎng)獼猴脫毛的營養(yǎng)學(xué)部分相關(guān)因素分析研究，可為實驗獼猴的人工飼養(yǎng)繁殖提供一定的營養(yǎng)學(xué)參考數(shù)據(jù)［20］，對脫毛的防治和改善被毛質(zhì)量可提供一定的指導(dǎo)作用。

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