長爪沙鼠ATPase8，ATPase6，COX3基因的克隆及序列分析

李長龍，柯賢福，盧領(lǐng)群，郭紅剛，薩曉嬰

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013）

長 爪 沙 鼠 （Mongolian Gerbil，Meriones unguiculatus）俗稱蒙古沙鼠，屬于嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬，又稱長爪沙土鼠、蒙古沙鼠和黃耗子等，野生長爪沙鼠主要分布于我國內(nèi)蒙古及其毗鄰的干旱和半干旱地區(qū)［1］。1935年大連衛(wèi)生所的春日送給日本北里研究所20對長爪沙鼠并開始馴化，后引種到美、英、法等國。我國有兩個(gè)主要的長爪沙鼠群體，分別保存于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和首都醫(yī)科大學(xué)［1］。長爪沙鼠具有獨(dú)特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)性狀，對于一些疾病（如：腦缺血、癲癇、高血脂、寄生蟲、細(xì)菌、病毒和老年性疾病等）的研究具有極為重要的價(jià)值，已在越來越多的研究所使用［2］。

線粒體是細(xì)胞的能源中心，在細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞凋亡和程序化死亡中發(fā)揮重要作用。線粒體DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，呈共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)。m tDNA結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快（是單拷貝核基因的5-10倍），呈嚴(yán)格的母性遺傳，遺傳行為相對獨(dú)立，變異發(fā)生的幾率相對穩(wěn)定、無組織特異性、提取方便［3］。由于mtDNA的遺傳特性，已被廣泛地用于物種起源與進(jìn)化、生物分類及群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究［4］。

本研究首次對長爪沙鼠線粒體 ATPase8，ATPase6，COX3基因全序列進(jìn)行測定和鑒定，并結(jié)合已公布嚙齒類動(dòng)物 ATPase8，ATPase6，COX3基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，旨在為長爪沙鼠系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和長爪沙鼠能量代謝研究提供遺傳學(xué)資料，為全長線粒體測定分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

長爪沙鼠來自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2008-033；使用許可證號(hào)：SYXK （浙）2008-0014］，長爪沙鼠解剖采集肝臟樣品，-20℃保存。

1.2 總DNA提取

采用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

分別參照長爪沙鼠 m tDNA序列 AB381914和MUU83801設(shè)計(jì)上下游引物［5-6］，引物由上海美吉生物公司合成。上游（COX2 3＇端）5＇-TCCAACCACAGCTTTATACCG-3＇，下游（ND3 5＇端） 5＇-GGCATGGACTTTTTCTGCAT-3＇。擴(kuò)增片段內(nèi)應(yīng)包括ATPase8，ATPase6，COX3三個(gè)編碼基因全序列及tRNA-Gly和tRNA-Lys等兩個(gè)tRNA基因全序列。

擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL：模板DNA 100 ng、10×buffer 2.5μL、MgC12（2.5 mol/L）2μL、dNTP 2μL、上下游引物（10 pmol/L）各1μL、1 U pfuDNA聚合酶，加滅菌純水補(bǔ)足。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56.5℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.4 序列純化、測序、拼接

用北京天根膠回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物由上海美季公司完成測序工作，Chromas 2.22校對測序圖，DNAMAN5.5拼接序列。

1.5 序列的鑒定和分析

從GenBank下載其他具有完整m tDNA基因組序列的18種嚙齒類動(dòng)物類的 ATPase8，ATPase6，COX3序列，GenBank登錄號(hào)分別為：NC_005089家鼠（Musmusculus）、NC_012387小家鼠（Musmusculus castaneus）、NC_006914西歐家鼠（Mus musculus domesticus）、NC_006915日本小鼠（Mus musculus molossinus）、NC_010339東歐家鼠（Mus musculus musculus）、NC_012389緬鼠（Rattus exulans）、NC_ 012461帥家鼠（Rattus praetor）、NC_012374黑家鼠（Rattus rattus）、NC_011638達(dá)氏家鼠 （Rattus tanezum i）、AC_000022褐家鼠（Rattus norvegicus）、NC_013068大倉鼠（Tscherskia triton）、NC_007936中國倉鼠（Cricetulus griseus）、NC_003041臺(tái)灣田鼠（Microtus kikuchii）、NC_001892胖睡鼠（Glis）、NC_ 005314非洲跳鼠（Jaculus）、NC_009056鱗尾松樹（Anomalurus）、NC_000884豚鼠（Cavia porcellus）和NC_002658蔗鼠（Thryonomys swinderianus）等。用DNAMAN5.5進(jìn)行同源性分析；用 EMBOSS中compseq程序統(tǒng)計(jì)堿基含量和計(jì)算 A和 G偏離［7］；用MEGA 4.0統(tǒng)計(jì)物種間遺傳距離，并基于Kimura-Parameter雙參數(shù)模型，用UPGMA和最小進(jìn)化法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 長爪沙鼠線粒體基因克隆和測序

從長爪沙鼠基因組 DNA中特異性克隆獲得1.9 kb的片段（圖 1）。經(jīng)過測序獲得長爪沙鼠m tDNA序列1952 bp，其中包括ATPase8，ATPase6，COX3編碼基因全序列、tRNA-Gly和tRNA-Lys轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因序列。

2.2 長爪沙鼠 ATPase8基因的鑒定及遺傳進(jìn)化分析

圖1 PCR擴(kuò)增長爪沙鼠線粒體DNA部分序列注：泳道DL5000為DL5000 Marker，泳道Product為線粒體DNA部分序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of PCR amplified the partical sequence ofm tDNA in Mongolian GerbilNote：The line 1 is DL5000 Marker，the line 2 is product of PCR amplified the partical sequence ofmtDNA

圖2 長爪沙鼠ATPase8與其他嚙齒類動(dòng)物同源性分析Fig.2 The homology analysis between Mongolian Gerbil ATPase8 yene and other rodents

長爪沙鼠ATPase8基因序列與其他嚙齒動(dòng)物的基因序列分別進(jìn)行序列比對、同源性分析和進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，長爪沙鼠 ATPase8基因序列全長204 bp，編碼67個(gè)氨基酸的序列。COX3基因與家鼠同源性為90％、與小家鼠同源性為98％，與倉鼠同源性為83％（圖2）。

利用MEGE4.1軟件將長爪沙鼠和18個(gè)嚙齒類動(dòng)物的ATPase8基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，家鼠、小家鼠分別聚合與A，B兩支，之后與長爪沙鼠分支聚合，之后依次為臺(tái)灣田鼠，非洲跳鼠，倉鼠等分支聚合（圖3）。分枝長表示分歧度，枝上的數(shù)值為1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到的支持率。分別選擇家鼠、黑家鼠、中國倉鼠、豚鼠、蔗鼠和睡鼠與長爪沙鼠計(jì)算遺傳距離?；贏TPase8基因結(jié)果顯示（表1），長爪沙鼠與家鼠遺傳距離最近為0.633；與黑家鼠遺傳距離為0.685；與中國倉鼠遺傳距離為0.867（表1）。

2.3 長爪沙鼠 ATPase6基因的鑒定及遺傳進(jìn)化分析

圖3 UPGMA法構(gòu)建的ATPase8基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ATPase8 sequences by UPGMA methods

長爪沙鼠ATPase6基因序列與其他嚙齒動(dòng)物的基因序列分別進(jìn)行序列比對、同源性分析和進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，長爪沙鼠 ATPase6基因序列全長681 bp，編碼226個(gè)氨基酸的序列。ATPase6基因與家鼠同源性為89％、與小家鼠同源性為98％，與倉鼠同源性為76％（圖4）。

利用MEGE4.1軟件將長爪沙鼠和18個(gè)嚙齒類動(dòng)物的ATPase6基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，家鼠、小家鼠分別聚合與A，B兩支，之后與中國倉鼠等倉鼠分支聚合，之后依次為長爪沙鼠等分支聚合（圖5）。分別選擇家鼠、黑家鼠、中國倉鼠、豚鼠、蔗鼠和睡鼠與長爪沙鼠計(jì)算遺傳距離。結(jié)果顯示（表 1），長爪沙鼠與家鼠遺傳距離最近為0.273；與黑家鼠遺傳距離為0.281；與中國倉鼠遺傳距離為0.29（表1）。

圖4 長爪沙鼠ATPase6與其他嚙齒類動(dòng)物的同源性分析Fig.4 The homology analysis between Mongolian Gerbil ATPase6 gene and other rodents

圖5 UPGMA法構(gòu)建的ATPase6基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.5 Phylogenetic tree based on ATPase6 sequences by UPGMA methods

2.4 長爪沙鼠COX3基因的鑒定及遺傳進(jìn)化分析

長爪沙鼠COX3基因序列與其他嚙齒動(dòng)物的基因序列分別進(jìn)行序列比對、同源性分析和進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，長爪沙鼠 COX3基因序列全長784 bp，編碼261個(gè)氨基酸的序列。COX3基因與家鼠同源性為90％；與小家鼠同源性為98％；與倉鼠同源性為80％（圖6）。

利用MEGE4.1軟件將長爪沙鼠和18個(gè)嚙齒類動(dòng)物的COX3基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，家鼠、小家鼠分別聚合與A，B兩支，之后與中國倉鼠等倉鼠分支聚合，之后依次為長爪沙鼠等分支聚合（圖7）。分別選擇家鼠、黑家鼠、中國倉鼠、豚鼠、蔗鼠和睡鼠與長爪沙鼠計(jì)算遺傳距離?；贑OX3基因結(jié)果顯示（表1），長爪沙鼠與家鼠遺傳距離最近為0.211；與黑家鼠遺傳距離為0.231；與中國倉鼠遺傳距離為0.244。基于ATPase8基因結(jié)果顯示（表1）

圖6 長爪沙鼠COX3與其他嚙齒類動(dòng)物的同源性分析Fig.6 The homology analysis between Mongolian Gerbil COX3 gene and other rodents

圖7 UPGMA法構(gòu)建的COX3基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.7 Phylogenetic tree based on COX3 sequences by UPGMA methods

2.5 基因序列組成分析

用EMBOSS中compseq程序統(tǒng)計(jì)長爪沙鼠3個(gè)基因的堿基含量和堿基偏離。長爪沙鼠ATPase8，ATPase6，COX3三個(gè)基因的中G（％）均為含量最少的堿基；A+T含量分別為59.2、64.1和68.2，均明顯高于 G+C的含量。A-skew的范圍為 -0.256 （COX3）至 -0.568（ATPase8）；G-skew的范圍為-0.030（COX3）至0.058（ATPase8）；堿基偏倚明顯（表2）。

表1 長爪沙鼠與其他鼠類遺傳距離Tab.1 The genetic distance between Mongolian Gerbil and other rodents

表2 長爪沙鼠ATPase8，ATPase6，COX3編碼序列的堿基組成Tab.2 The nucleotide composition in COX3，ATPase6，ATPase8 gene sequence of Mongolian Gerbil

3 討論

3.1 長爪沙鼠 ATPase8，ATPase6，COX3基因序列的測定和鑒定

哺乳動(dòng)物m tDNA內(nèi)包含13個(gè)編碼基因，均參與呼吸的電子傳遞［9］。三磷酸腺苷酶亞基 6、8 （adenosine triphosphatase 6、8，ATPase6、ATPase8）和胞色素氧化酶亞基3（cytochrome oxidase，COX3）在m tDNA上呈相鄰分布，均可用于分子進(jìn)化研究［10-12］。ATPase是生物體內(nèi)廣泛存在細(xì)胞膜上的一種極為重要的酶，功能主要是維持細(xì)胞內(nèi)外離子及滲透壓和跨膜電化學(xué)平衡以及細(xì)胞能量代謝。ATPase 8和 ATPase 6基因是編碼 ATPase（又稱F0F1-ATPase酶復(fù)合物）F0部分的基因，是呼吸鏈電子傳遞中不可或缺的部分［3］。COX3是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，屬亞鐵血紅素，銅氧化酶的超家族，是線粒體氧化能力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)部位［13］。

m tDNA是閉合的雙鏈環(huán)狀 DNA，ATPase8，ATPase6，COX3依次排列于 m tDNA中段，在 COX2和ND3基因之間。本研究根據(jù)已知的長爪沙鼠COX2和ND3基因部分序列分別設(shè)計(jì)上下游引物，并在基因組DNA中擴(kuò)增出約1.9 kb的DNA片段（圖1）。共測得長爪沙鼠m tDNA序列1952 bp，其中包括ATPase8，ATPase6，COX3編碼基因全序列、tRNA-Gly和 tRNA-Lys轉(zhuǎn)運(yùn) RNA基因序列。序列比對和同源分析結(jié)果顯示，長爪沙鼠線粒體COX3序列全長為 784bp，ATPase6序列全長為 681 bp，ATPase8序列全長為 204 bp（圖 8）；ATPase8和 ATPase6基因間存在43 bp的堿基重疊，ATPase6和COX3基因間存在1 bp的堿基重疊。本研究選擇18種不同的嚙齒類動(dòng)物線粒體 ATPase8，ATPase6，COX3基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，長爪沙鼠3個(gè)基因與家鼠、小家鼠和倉鼠序列同源性在76％～98％之間。線粒體基因由于沒有組氨酸保護(hù)，而且處于高氧化條件之下，其突變頻率較核基因高［3］，因此認(rèn)定上述序列為長爪沙鼠 ATPase8，ATPase6，COX3基因全序列。

3.2 長爪沙鼠線粒體DNA序列及進(jìn)化分析

動(dòng)物的起源進(jìn)化長期以來一直困擾著遺傳學(xué)家。分子遺傳學(xué)方法為研究群體的起源和進(jìn)化開辟了新的途徑［7］。m tDNA比核DNA的突變率高5～10倍［8］。利用m tDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能很好的反映動(dòng)物母系的遷徙和進(jìn)化。許多科學(xué)家利用m tDNA序列差異來研究動(dòng)物的遺傳多樣性與起源演化，取得了一系列令人矚目的成果［14］。

不同物種的mtDNA堿基組成和特性存在明顯的差異［15］。DNA的鳥嘌呤和胞嘧啶的堿基含量（G +C含量）在不同物種的基因組中波動(dòng)范圍廣闊［16］，甚至在同一物種的基因組不同區(qū)域也不相同。這種基因組局部堿基不均衡的現(xiàn)象表現(xiàn)為不同區(qū)域的核苷酸堿基組成存在差異［17］。長爪沙鼠ATPase8，ATPase6，COX3基因編碼序列中堿基 G的含量分別為6.9％，10.7％，15.2％，明顯低于其他堿基的含量m tDNA的一個(gè)顯著特征［18］；A+T含量分別為68.2％，64.1％，59.2％，符合哺乳動(dòng)物A、T含量高，G、C含量低的特點(diǎn)相似［19］。

圖8 長爪沙鼠ATPase8，ATPase6，COX3基因序列Fig.8 The complete sequence of ATPase8，ATPase6，COX3 gene in Mongolian Gerbil序列陰影部分為

Chevret等［20］曾利用 DNA在溶解溫度的方法研究長爪沙鼠與家鼠和小家鼠的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示長爪沙鼠與家鼠和小家鼠存在較相近的進(jìn)化關(guān)系。Colangelo等［21］利用cyt B和16S rRNA具有序列研究在非洲的沙鼠的分子進(jìn)化關(guān)系；Chevret等［22］利用cyt B和12S rRNA基因序列研究沙鼠亞科內(nèi)分子進(jìn)化關(guān)系。李長龍等［2］利用 D-Loop區(qū)序列分析長爪沙鼠，結(jié)果顯示長爪沙鼠與家鼠、小家鼠和倉鼠存在較相近的進(jìn)化關(guān)系。

本研究應(yīng)用 MEGA 4.0軟件，分別基于ATPase8，ATPase6，COX3基因全序列，用 UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹得到相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，家鼠和小家鼠均分別聚合為一支。在基于ATPase8和 COX3基因構(gòu)建的進(jìn)化樹中，長爪沙鼠最先與家鼠和小家鼠的分支聚合，之后與倉鼠分支結(jié)合；在基于ATPase8基因構(gòu)建的進(jìn)化樹中，倉鼠屬的3個(gè)動(dòng)物先與家鼠和小家鼠的分支聚合，之后在與長爪沙鼠分支聚合。說明家鼠、小家鼠、倉鼠和長爪沙鼠遺傳關(guān)系較近。分別基于 ATPase8，ATPase6，COX3基因的遺傳距離分析結(jié)果基本驗(yàn)證了進(jìn)化分析結(jié)果，長爪沙鼠與家鼠的遺傳距離最近，與黑家鼠和倉鼠的遺傳距離較近，與蔗鼠、豚鼠、睡鼠等其他動(dòng)物遺傳距離較遠(yuǎn)。

從3個(gè)基因編碼序列分析顯示，基于相同動(dòng)物不同基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹存在一定的差異。于燕等發(fā)現(xiàn)，基于黑鱸不同脂代謝相關(guān)基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)結(jié)果也存在不同，研究者認(rèn)為其原因是基因進(jìn)化速率的不同所導(dǎo)致。研究者認(rèn)為組織分布單一、功能簡單、直接作用于靶分子的蛋白質(zhì)、其編碼基因序列變化大，適于反映近緣物種的親緣關(guān)系；組織分布廣、功能多樣、作用機(jī)理復(fù)雜的基因適于分析遠(yuǎn)緣物種間的親緣關(guān)系［23］。利用長爪沙鼠D-Loop區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹與本研究也存在不同［2］，其原因可能是 D-loop區(qū)的進(jìn)化速率是m tDNA其他區(qū)域的3～5倍多導(dǎo)致。但是，以上數(shù)據(jù)根據(jù)m tDNA部分序列計(jì)算得出，進(jìn)一步研究應(yīng)采用m tDNA全序列信息并增加動(dòng)物數(shù)量，在充分參考考古學(xué)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合分析。

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