趙金紅,許金鵬,李朝品

(1.皖南醫(yī)學院 人體寄生蟲學教研室,安徽 蕪湖 241002;2.安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 檢驗科,安徽 合肥230031)

原卟啉鈉(Protoporphyrin disodium,NAPP)是一種卟吩衍生物,化學名稱為1,3,5,8-四甲基-2,4-二乙烯基卟吩-6,7-二丙酸鈉,由4個吡咯環(huán)經(jīng)4個次甲基鍵連接而成的含共軛雙鍵的大環(huán)化合物,可促進組織細胞呼吸,改善蛋白質(zhì)和糖代謝,具有保肝降酶作用,臨床用于治療急、慢性肝炎,并對肝硬化、膽囊炎及膽石癥有一定療效[1,2]。目前制備原卟啉鈉的工藝普遍存在操作繁雜、中間產(chǎn)物多、周期長、制備成本高等缺點[3～5]。為克服上述不足,本研究以血紅素為原料,建立并優(yōu)化了原卟啉鈉制備工藝,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 血紅素(本實驗室自制,純度為90.8%),丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、甲醇、氯仿、甲苯、硫酸亞鐵等(國產(chǎn)分析純),溴化鉀(國產(chǎn)光譜純),原卟啉鈉標準品(Sigma公司,純度≥98.0%);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE-2000),循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司,SHB-Ⅲ),超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司,JY96-Ⅱ),紫外分光光度計(蘇州島津,UV-2550)。

1.2 原卟啉鈉的制備工藝 血紅素5.0 g加入甲醇與氯仿的混合液中(甲醇:70 ml,氯仿:120 ml),再加硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)4.5 g,攪拌20 min,通氯化氫氣體60 min(脫鐵)。反應(yīng)液移入三角燒瓶內(nèi),90℃加熱回流2 h(酯化),冷卻后,抽濾,用100 ml氯仿沖洗沉淀,收集濾液,加入等體積雙蒸水,用力振蕩,洗滌濾液,轉(zhuǎn)入分液漏斗內(nèi),靜置分層,分取氯仿層(生成的原卟啉二甲酯溶于其中,呈紫紅色),繼續(xù)加適量雙蒸水洗滌氯仿層至中性,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去氯仿層中的氯仿,原卟啉二甲酯析出,向回收氯仿后的殘留物中加入50 ml甲苯,加熱,待析出的沉淀溶解后,再加入1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液80 ml,90℃加熱回流2 h(皂化),冷卻后原卟啉鈉生成析出,抽濾,用適量氯仿洗滌2次后干燥,即得原卟啉鈉,稱重,并計算原卟啉鈉產(chǎn)率。

1.3 原卟啉鈉樣品的定性測定 紫外-可見吸收光譜法:將原卟啉鈉標準品與提取的原卟啉鈉樣品105℃干燥至恒重,準確稱量干燥好的原卟啉鈉標準品和樣品,用1%鹽酸甲醇溶液溶解,制成200 mg/L的標準品和樣品溶液的母液備用。再分別制成2.00 mg/L的稀溶液,用紫外分光光度計于300～700 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.4 原卟啉鈉樣品的含量和純度測定

1.4.1 原卟啉鈉標準曲線的繪制 以1%鹽酸甲醇溶液為空白,用紫外分光光度計于最大吸收波長409 nm處測定不同濃度的原卟啉鈉標準品溶液的吸光度。以原卟啉鈉標準品溶液的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程。

1.4.2 原卟啉鈉的精密度和回收率

1.4.2.1 精密度:量取原卟啉鈉標準品母液,制成2.00 mg/L的標準品溶液,在409 nm處測定其吸光度,計算相對標準偏差(RSD)結(jié)果。

1.4.2.2 回收率:量取9份原卟啉鈉樣品母液0.50 ml,分為3組。每組分別加入原卟啉鈉標準品母液0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml,用1%鹽酸甲醇溶液定容至100 ml,測定結(jié)果作為加樣回收試驗的測得回收量。此外,另分別移取原卟啉鈉樣品母液0.50 ml和原卟啉鈉標準品母液0.25 ml、0.50 ml、1.00 ml,用1%鹽酸甲醇溶液定容至100 ml,測定結(jié)果作為樣品加入量和標準品加入量。在409 nm處分別測溶液的吸光度,代入回歸方程計算加樣回收率。

1.4.3 原卟啉鈉樣品的含量和純度測定 制濃度為2.00 mg/L的原卟啉鈉樣品溶液,以1%鹽酸甲醇溶液為空白,在409 nm波長處測得吸光度,代入回歸方程,計算出2.00 mg/L的原卟啉鈉樣品溶液中原卟啉鈉含量,并利用純度計算公式計算提取的原卟啉鈉樣品的純度。

1.5 單因素試驗對原卟啉鈉制備工藝的優(yōu)化 根據(jù)預實驗結(jié)果和影響酯化、皂化反應(yīng)的因素、條件等,本研究選擇酯化時甲醇用量、皂化時的1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量、加熱回流溫度、加熱回流時間4個主要因素,采用單因素方法,以血紅素為原料,對NAPP的制備工藝進行優(yōu)化。

每次以5.0 g血紅素為原料,按上述制備工藝制備原卟啉鈉,比較酯化時不同甲醇用量(50 ml、60 ml、70 ml、80 ml)、皂化時不同1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量(60 ml、70 ml、80 ml、90 ml)、不同加熱回流溫度(70℃、80℃、90℃、100℃)、不同加熱回流時間(1 h、1.5 h、2 h、2.5 h)對原卟啉鈉產(chǎn)率的影響,以確定最佳的制備條件和參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 原卟啉鈉樣品的一般性質(zhì)和產(chǎn)量 制備的原卟啉鈉為紫褐色結(jié)晶,易溶于水和酸性甲醇溶液,微溶于稀鹽酸溶液,不溶于氯仿,105℃不熔解。該法制備原卟啉鈉的平均產(chǎn)量為3.46 g/5 g血紅素,平均產(chǎn)率為69.2%。

2.2 原卟啉鈉樣品的定性結(jié)果 紫外-可見吸收光譜法結(jié)果顯示,于300～700 nm波長范圍內(nèi),原卟啉鈉樣品與標準品的光譜圖基本一致,分別在409 nm、556 nm、600 nm波長處顯示吸收峰,最大吸收峰在409 nm處(圖1)。

圖1 原卟啉鈉樣品與原卟啉鈉標準品的紫外-可見吸收光譜圖1.原卟啉鈉標準品;2.原卟啉鈉樣品Fig 1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of NAPP sample and standard substance1.NAPP standard substance;2.NAPP sample

2.3 原卟啉鈉樣品的含量和純度 原卟啉鈉標準曲線的回歸方程為у=0.3801x+0.0029(R2=0.9997),相關(guān)系數(shù)趨近于1,該回歸方程可用于計算原卟啉鈉樣品中原卟啉鈉的含量。平均吸光度值為0.7545,RSD=0.32%(n=6),平均回收率為99.49%,RSD=1.99%(n=9),表明該法測定原卟啉鈉的精密度、回收率良好。

經(jīng)計算,原卟啉鈉樣品溶液中原卟啉鈉含量為1.74 mg/L,純度為88.8%。

2.4 原卟啉鈉制備工藝優(yōu)化的結(jié)果

2.4.1 最佳甲醇用量 實驗結(jié)果顯示,甲醇用量為50 ml時,原卟啉鈉產(chǎn)率僅23.5%,隨著甲醇用量的增加,原卟啉鈉產(chǎn)率增高,當甲醇用量達到70 ml時,原卟啉鈉產(chǎn)率達68.7%,但當用量為80 ml時,產(chǎn)率幾乎不再增高(圖2),結(jié)合成本等因素,故確定最佳甲醇用量為70 ml。

2.4.2 最佳1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量 實驗結(jié)果顯示,1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量為60 ml時,原卟啉鈉產(chǎn)率為45.3%,隨著加入量的增加,原卟啉鈉產(chǎn)率相應(yīng)增高,當1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量達到80 ml時,原卟啉鈉產(chǎn)率達67.5%,但當加入90 ml時,產(chǎn)率為68.2%,增高不明顯(圖3),鑒于成本考慮,確定最佳的1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量為80 ml。

圖3 不同1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量對原卟啉鈉產(chǎn)率的影響Fig 3 Effect of different concentration of 1 mol/L sodium hydroxide-methanol solution on yield of NAPP

2.4.3 最佳加熱回流溫度 實驗結(jié)果顯示,加熱回流溫度為70℃時,原卟啉鈉產(chǎn)率僅為31.5%,隨著溫度的升高,原卟啉鈉產(chǎn)率隨之增高,加熱回流溫度為90℃時原卟啉鈉產(chǎn)率增至69.1%,但當加熱回流溫度升至100℃時,原卟啉鈉產(chǎn)率反而下降至60.8%(圖4),故確定最佳加熱回流溫度為90℃。

2.4.4 最佳加熱回流時間 實驗結(jié)果顯示,加熱回流1 h時原卟啉鈉產(chǎn)率僅43.8%,隨著加熱回流時間延長,原卟啉鈉產(chǎn)率迅速增高,當加熱回流2 h時其產(chǎn)率迅速增加至65.5%,但加熱回流時間延長至2.5 h時原卟啉鈉產(chǎn)率僅增加1.6%(圖5),鑒于成本和生產(chǎn)周期等因素考慮,因而確定最佳加熱回流時間為2 h。

圖4 不同加熱回流溫度對原卟啉鈉產(chǎn)率的影響Fig 4 Impact of different heating and distilling temperature on yield of NAPP

圖5 不同加熱回流時間對原卟啉鈉產(chǎn)率的影響Fig 5 Impact of different heating and distilling time on yield of NAPP

3 討論

原卟啉鈉在體內(nèi)外具有一定的抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)作用,亦有報道NAPP對肝癌、胃癌、食道癌、肺癌等有抑制癌性疼痛、預防轉(zhuǎn)移、增加食欲的作用[6,7]。目前報道的以血紅素為原料制備原卟啉鈉的方法大多需經(jīng)過粗原卟啉、原卟啉二甲酯、原卟啉純品等中間制備過程才能制得原卟啉鈉。存在的缺點是中間產(chǎn)物多、操作繁雜、生產(chǎn)周期長、需要柱層析分離純化及制備成本高等[3～5]。本研究中原卟啉鈉的制備是以本實驗室自制的血紅素為原料,經(jīng)硫酸亞鐵-氯化氫氣體-甲醇-氯仿脫鐵酯化成原卟啉二甲酯,原卟啉二甲酯無需分離,直接經(jīng)氫氧化鈉甲醇溶液皂化制得原卟啉鈉。這樣既減少了中間產(chǎn)物,簡化了操作步驟,又革除了柱層析,制備周期大大縮短,所用氯仿又可經(jīng)蒸餾回收而重復利用,既降低了制備成本,又減少了其對環(huán)境的污染。

本研究根據(jù)酯化與皂化反應(yīng)的條件和特點及預試驗的結(jié)果選擇了酯化時的甲醇用量、皂化時的1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量、加熱回流溫度、加熱回流時間4個因素,分別研究了其對原卟啉產(chǎn)率的影響。結(jié)果顯示,甲醇用量達70 ml時,酯化反應(yīng)速率已達到最高,即使增加甲醇用量也不能促進酯化反應(yīng)進行;隨著氫氧化鈉甲醇溶液量的增加,促進皂化反應(yīng)的進行,原卟啉鈉產(chǎn)率隨之增高,當用量達80 ml時,反應(yīng)速率已達到最高,即使再增加氫氧化鈉甲醇溶液量也不能促進皂化反應(yīng)進行;溫度升高可以促進酯化和皂化反應(yīng)進行而使原卟啉鈉生成增加,但酯化和皂化反應(yīng)是可逆反應(yīng),當加熱回流溫度升至100℃時,原卟啉鈉產(chǎn)率反而下降至60.8%,可能由于酯化和皂化反應(yīng)的逆反應(yīng)速率更快而使原卟啉鈉生成減少,產(chǎn)率下降。故確定最佳甲醇用量為70 ml,最佳1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液用量為80 ml,最佳加熱回流溫度為90℃,最佳加熱回流時間為2 h。

本研究建立了原卟啉鈉的制備工藝,并確定了最佳制備條件,這為原卟啉鈉的生物活性研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]樊德厚,王永利.中國藥物大全·西藥卷[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:453.

[2]L ICP,XU LF,L IU QH,et al.Extration of protoporphyrin disodium and its inhibitory effectson HBV-DNA[J].World J Gastroenterol,2004,10(3):433-436.

[3]韓長日,宋小平.藥物制造技術(shù)[M].北京:科學技術(shù)文獻出版社,2001:385-386.

[4]陳文暉,楊洪勤,許德余.原卟啉鈉的制備方法改進[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2000,31(7):293-294.

[5]許金鵬,李朝品.原卟啉鈉的制備方法研究進展[J].熱帶病與寄生蟲學,2009,7(3):177-179.

[6]劉群紅,范巧云.原卟啉鈉的抗鴨乙型肝炎病毒作用[J].中國實驗方劑學雜志,2008,14(3):46-52.

[7]LIL IN,J IANM ING HU.Inhibition of Hepadnavirus Reverse Transcriptase-εRNA interaction by porphyrin compounds[J].Journal of Virology,2008,82(5):2305-2312.