優(yōu)化分光光度法用于玄參中總環(huán)烯醚萜類成分的含量測定

張雪梅， 王 瑞， 吳喜民， 王新宏， 高文運， 李醫(yī)明*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203;2.西北大學(xué)，陜西 西安710069)

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有涼血滋陰，瀉火解毒的功效［1］，為傳統(tǒng)常用中藥?；瘜W(xué)研究表明玄參中含有多種環(huán)烯醚萜類成分如哈巴苷、哈巴俄苷、8-O-阿魏?；蛙?、8-O-(2-羥基肉桂酰基)哈巴苷、6-O-α-D-半乳糖基哈巴俄苷、6′-O-乙酰哈巴苷等［2-4］，藥理研究表明這些成分具有抗炎、抗菌、抗氧化、保肝等多種活性［5-9］，因而對玄參中環(huán)烯醚萜類成分進行質(zhì)量控制十分必要。目前對玄參中環(huán)烯醚萜類成分的含量測定應(yīng)用較多的是HPLC方法，且主要集中在哈巴苷和哈巴俄苷，由于玄參中還存在大量其它環(huán)烯醚萜類成分，而這些成分目前沒有標準品，因而HPLC方法目前還不能很好的測定玄參中總環(huán)烯醚萜類成分的含量。為了更好的測定玄參中總環(huán)烯醚萜類成分的含量，本試驗首先對文獻報道的萜類化合物的顯色方法，如 Trim-Hill、Shear、Epstahl及 5%香蘭素冰醋酸顯色反應(yīng)［10-12］進行篩選，確定針對玄參中環(huán)烯醚萜類成分的顯色方法，然后對此方法用正交實驗進行了優(yōu)化，用于玄參中總環(huán)烯醚萜類成分的含量測定，獲得了較為滿意的結(jié)果，現(xiàn)報道如下:

1 儀器與試藥

D1901紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，1 cm比色皿，SB-1000恒溫水浴鍋(上海愛朗儀器有限公司)，XS205DU電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SK5200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

Trim-Hill試劑(冰醋酸10 mL、0.2%硫酸銅水溶液 1 mL、濃硫酸 0.5 mL 混合)［10］，Shear試劑(鹽酸∶苯胺 =1 ∶15 的混合液)［10］，Epstahl試劑(對二甲氨基苯甲醛0.25 g，冰醋酸50 g，85%磷酸5 g，水20 mL 混合)［10］，5% 香蘭素冰醋酸［11］，冰醋酸，磷酸，高氯酸，鹽酸，硫酸，上述試劑均為分析純，水為去離子水。

哈巴俄苷(批號111730-200605)標準品購于中國藥品生物制品檢定所。對照品哈巴苷，8-O-阿魏?；蛙?，8-O-(2-羥基肉桂酰基)哈巴苷，6-O-α-D-半乳糖基哈巴俄苷，6′-O-乙酰哈巴苷均為自行分離精制，并經(jīng)1HNMR、13CNMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測，面積歸一化法計算純度均大于98%。實驗所用玄參(批號20091016)購自上海養(yǎng)和堂中藥飲片廠，于55℃烘干，粉碎，過三號篩，備用。

2 溶液制備

2.1 對照品溶液

精密稱取哈巴俄苷對照品適量，加50%甲醇水溶液配置成濃度為0.100 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液

取玄參粉末約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(功率200 W，頻率53 kHz)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

3 顯色條件

3.1 顯色方法的確定

Trim-Hill試劑能與玄參中環(huán)烯醚萜類成分如哈巴苷、哈巴俄苷、8-O-阿魏?；蛙?、8-O-(2-羥基肉桂?；?哈巴苷、6-O-α-D-半乳糖基哈巴俄苷、6′-O-乙酰哈巴苷等反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色，但顯色所需時間太長。

Shear試劑和Epstahl試劑能與上述環(huán)烯醚萜類成分產(chǎn)生特有的顏色，但是反應(yīng)緩慢，易于變渾濁，難以進行定量，僅適宜定性研究。

5%香蘭素冰醋酸與上述環(huán)烯醚萜類成分反應(yīng)靈敏迅速，產(chǎn)生的紫紅色產(chǎn)物穩(wěn)定，經(jīng)比色法觀察1 h內(nèi)吸收度變化范圍小于0.79%，符合定量分析要求。

3.2 測定波長的確定

在酸性催化條件下，5%香蘭素冰醋酸能與上述環(huán)烯醚萜類成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使之產(chǎn)生明顯的紫紅色。該反應(yīng)能定量進行，生成的有色產(chǎn)物在60 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定，且玄參中其他成分如苯丙素、多糖等對其干擾小。由吸收光譜圖可見，該類化合物的最大吸收波長在528 nm，實驗采用此波長為測定波長。

3.3 酸催化劑種類的選擇

酸催化是影響此顯色反應(yīng)的重要因素，故本實驗以哈巴俄苷為對照品對酸的種類進行了選擇，結(jié)果見表1。

實驗結(jié)果表明，高氯酸和磷酸反應(yīng)不完全，顯色效果差，鹽酸和硫酸催化效果均較好，但硫酸反應(yīng)穩(wěn)定，顯色靈敏，綜合考慮選用硫酸做催化劑。

表1 酸催化劑種類的選擇(λ=528 nm)

3.4 顯色條件的選擇—正交實驗

對5%香蘭素冰醋酸顯色反應(yīng)研究表明，影響顯色的因素有4個，即顯色劑用量、顯色時間、顯色溫度和硫酸用量等。本實驗以哈巴俄苷為對照品，應(yīng)用正交實驗表L9(34)對影響顯色的因素進行實驗優(yōu)化，結(jié)果見表2。

以吸光度為考察指標，極差值顯示，各因素作用主次為A＞D＞C＞B;方差分析結(jié)果表明:A、D因素的影響均有顯著性意義。綜合上述兩項考察指標，優(yōu)化水平組合應(yīng)為A3B1C3D3，即取對照品溶液0.5 mL置于試管中，依次加入0.4 mL 5%香蘭素冰醋酸，1.2 mL硫酸，3 mL冰醋酸，于水浴鍋中60℃下加熱15 min進行顯色。

表2 實驗因素水平

表3 正交實驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

3.5 最佳顯色條件的驗證實驗

取0.030 mg/mL的哈巴俄苷對照品溶液6份，按最佳顯色條件平行操作，測定吸光度值分別為0.338，0.329，0.346，0.356.，0.340，0.329，表明本最佳顯色條件合理，而且具有較好的穩(wěn)定性。

4 玄參中環(huán)烯醚萜類成分的含量測定

4.1 線性關(guān)系考察

精密量取2.1項下對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，分別置于 10 mL 量瓶中，加50%甲醇水定容至10 mL，搖勻。再取上述不同濃度的對照品溶液0.5 mL，按最佳顯色條件操作，以試劑空白為參比測定吸光度，得到如下回歸方程:

式中Y為吸光度(AU)，X為溶液中哈巴俄苷的濃度(mg/mL)，該方程在所測范圍內(nèi)(0.010～0.040 mg/mL)線性關(guān)系良好。

4.2 精密度實驗

取0.025 mg/mL的哈巴俄苷對照品溶液0.5 mL，按最佳顯色方法操作，測定吸光度。結(jié)果:RSD=0.12%(n=6)，表明本法精密度良好。

4.3 穩(wěn)定性實驗

按2.2項下制備樣品溶液，取0.5 mL按最佳顯色方法操作，測定吸光度，每隔10 min測定1次。結(jié)果1 h內(nèi)測得吸光度的RSD=0.79%(n=7)，表明樣品溶液在1 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.4 重復(fù)性實驗

按2.2項下制備樣品溶液，取0.5 mL按最佳顯色方法操作，測定吸光度。結(jié)果:RSD=2.56%(n=6)，表明本法重現(xiàn)性良好。

4.5 回收率實驗

精密稱取已測知含量的樣品(含量為2.968%)，分別加入一定量的哈巴俄苷對照品，制備成樣品溶液，測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率(n=9)

4.6 樣品的測定

按2.2項下制備樣品溶液，取0.5 mL按最佳顯色方法操作，測定吸光度，計算玄參中總環(huán)烯醚萜類成分的含量，其結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地玄參總環(huán)烯醚萜類成分的含量

11個產(chǎn)地樣品中環(huán)烯醚萜類成分的含量在1.910%～3.446%之間，其中浙江產(chǎn)玄參總環(huán)烯醚萜類成分含量較高，山東產(chǎn)玄參總環(huán)烯醚萜類成分含量則較低。各產(chǎn)地氣候、土壤等環(huán)境條件是影響含量的重要因素。

5 結(jié)論

通過上述研究說明，紫外可見分光光度法適合玄參中總環(huán)烯醚萜類成分的含量測定。由于方法簡單，對儀器的要求低，結(jié)果可靠，此方法可在醫(yī)藥企業(yè)特別是原藥材產(chǎn)地作為控制藥材質(zhì)量的方法。

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