桑生除痹合劑對膝骨性關(guān)節(jié)炎兔組織形態(tài)學和血液流變學的影響

王 平，盧啟貴，徐 展，孫克民，黃東紅，裴代平

深圳平樂骨傷科醫(yī)院關(guān)節(jié)病科，廣東深圳 518010

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常見、多發(fā)和比較難治的一種慢性進行性骨關(guān)節(jié)病。隨著年齡的增長和社會人口老齡化進程加劇，OA的發(fā)病率明顯增高，嚴重危害著中老年人的健康。桑生除痹合劑是國家級名老中醫(yī)郭春園教授的經(jīng)驗方，經(jīng)深圳平樂骨傷科醫(yī)院制劑車間按現(xiàn)代工藝生產(chǎn)用于治療骨性關(guān)節(jié)炎，經(jīng)多年使用收到較好的效果。本實驗旨在通過組織病理切片技術(shù)、血液流變學分析，觀察桑生除痹合劑對膝關(guān)節(jié)炎家兔的軟骨、滑膜組織的病理改變和血液流變學的影響，探索桑生除痹合劑防治OA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取健康的6月齡新西蘭大白兔36只，體重（2 000±100）g，雌雄各半，由上海醫(yī)用動物實驗中心提供，合格證書：SCXK（滬）2002-0011。隨機將其分為6組，即正常組、模型組、對照組（壯骨關(guān)節(jié)丸）、桑生除痹合劑低（治療Ⅰ組）、中（治療Ⅱ組）、高（治療Ⅲ組）劑量組，每組6只。采用一兔一籠喂養(yǎng)方式，室溫 20～25℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

桑生除痹合劑由深圳平樂骨傷科醫(yī)院制劑室提供，制劑批準文號：粵藥制字04000136。主要成分為：桑寄生、續(xù)斷、山藥、枸杞子、五加皮、骨碎補、防風、羌活、防已、秦艽、威靈仙、白術(shù)、茯苓、澤瀉、當歸、川芎、白芍、生地黃、川牛膝、丹皮、地龍、木瓜、甘草。壯骨關(guān)節(jié)丸主要由狗脊、骨碎補、淫羊霍、獨活、木香、雞血藤、川斷、熟地等藥物組成（南方制藥廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：N20050815）。

1.3 動物造模及給藥

同等條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，取造模組、對照組（壯骨關(guān)節(jié)丸）、桑生除痹合劑低、中、高劑量組按照Hulth法[1]行改良手術(shù)造模[2]，各組動物于術(shù)前禁食、水10 h，以兔左膝為手術(shù)對象，在動物實驗室，無菌條件下實行手術(shù)。術(shù)前用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg的劑量行耳緣靜脈麻醉，并配合鹽酸利多卡因注射液局部肌注麻醉以松弛肌肉。麻醉后，將兔仰臥捆綁于兔解剖臺上，左膝關(guān)節(jié)局部脫毛、備皮、消毒、鋪巾，取髕內(nèi)側(cè)縱切口，長約2 cm，依次切開皮膚，淺、深筋膜，在直視下分離、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，打開膝關(guān)節(jié)腔，完整摘除內(nèi)側(cè)半月板并切斷前交叉韌帶，術(shù)中盡量避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面，抽屜試驗、內(nèi)側(cè)應(yīng)力試驗證實各韌帶完全切斷后，沖洗，徹底止血，逐層縫合。無敷料包扎，不固定傷肢。術(shù)后連續(xù)3 d青霉素肌注20萬U，每日2次，以預防感染。手術(shù)1周后，每日強迫動物活動30 min，分2次驅(qū)趕。按人與動物體表面積換算法計算給藥劑量，每日灌胃液體量為10 ml。高劑量組（治療Ⅰ組）藥物濃度為5.06 g/ml；中劑量組（治療Ⅱ組）藥物濃度為2.53 g/ml；低劑量組（治療Ⅲ組）藥物濃度為1.27 g/ml。對照組每日灌胃液體量為10 ml，含生藥量為0.12g/ml。將壯骨關(guān)節(jié)丸碾成粉末，用生理鹽水配制成濃度為0.12 g/ml水溶液。將藥物置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察指標

1.4.1 關(guān)節(jié)滑膜及軟骨病理組織制片 用靜脈空氣栓塞法處死實驗動物，立即打開兔患膝關(guān)節(jié)腔，用手術(shù)解剖刀緊貼關(guān)節(jié)囊內(nèi)壁，小心剝?nèi)∠リP(guān)節(jié)前正中的部分關(guān)節(jié)滑膜，置入EP管內(nèi)，10%福爾馬林固定。用骨剪取股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨，修成5 mm×5 mm×3 mm的全軟骨層標本，10%福爾馬林固定，MAIXIN-BIO Rapid Cal·ImmunoTM快速脫鈣液脫鈣，梯度乙醇常規(guī)脫水，二甲苯透明后浸臘包埋。連續(xù)4 μm厚切片，鋪片，烘干，滑膜標本作HE染色，軟骨標本一份作HE染色，一份作Masson三色染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學改變。

1.4.2 血液流變學測定 各組動物于取材前禁食10 h，將兔仰臥位固定于兔臺上，備皮，用注射器滴入少許2%肝素生理鹽水，使之充滿骨穿針腔。用一次性注射器自耳中動脈抽取4 ml血，注入抗凝試管，搖勻，室溫下保存，3 h內(nèi)送檢。測血流變學指標。

1.5 統(tǒng)計學方法

結(jié)果采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計方法為單因素方差分析，以 P＜0.05 或 P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨、滑膜光鏡觀察

軟骨按Beninghoff法由淺入深分為表層、移形層、輻射層和鈣化層4層。

2.1.1 正常組 關(guān)節(jié)軟骨面表面平滑，無鈣化，表層細胞小而扁平，少見細胞分裂，4層結(jié)構(gòu)清晰可辨，軟骨細胞排列成柱狀，未見軟骨細胞簇，潮線完整。Masson染色軟骨膠原藍綠色，鈣化軟骨及骨的膠原呈紅色，滑膜細胞呈單層排列，間質(zhì)無水腫，無炎癥細胞浸潤聚積，有的可見少量毛細血管增生。

2.1.2 模型組 關(guān)節(jié)軟骨表層菲薄，粗糙，部分因受蝕損，表面剝脫、纖維化，形成缺損區(qū)，可見多個空隙窩。部分區(qū)域成絨毛狀，表層裂隙多且深，向下能深達輻射層，裂隙中可見稀疏結(jié)締組織及松散的網(wǎng)狀連接，裂隙周圍可見脫水固縮壞死的軟骨細胞。軟骨細胞排列不規(guī)則，各層結(jié)構(gòu)不易分辨，潮線多不完整或完全消失。軟骨細胞增生顯著，大部分是散在增生和巢狀增生，部分軟骨細胞核固縮壞死，偏于一側(cè)，鈣化層可出現(xiàn)軟骨細胞簇積現(xiàn)象；Masson染色見軟骨藍綠色染色丟失嚴重，潮線上普遍有向上的火焰狀突起的紅染物，幾乎達到軟骨表層；滑膜明顯增厚，纖維組織大量增生，滑膜可見大量炎癥細胞（如淋巴細胞）浸潤、聚積，滑膜下毛細血管增生，間質(zhì)水腫。

2.1.3 對照組 軟骨面也見粗糙，表面有少許表淺裂隙，但裂隙表淺，軟骨細胞排列較整齊，呈柱狀，表淺層軟骨細胞大量消失，放射層軟骨細胞萎縮，鈣化層軟骨細胞輕度成簇，但細胞增生明顯少于模型組，潮線較整齊，部分軟骨剝脫，出現(xiàn)少許空隙窩；Masson染色見全層未鈣化軟骨藍綠染色達2/3以上，紅色火焰狀升起相對低而少；滑膜細胞、纖維組織輕度增生，毛細血管增生，間質(zhì)有水腫，伴有少量淋巴細胞浸潤。

2.1.4 治療組 治療Ⅱ組軟骨表面尚光滑，軟骨細胞排列整齊，呈柱狀；未見明顯軟骨剝脫，無明顯空隙窩，細胞減少現(xiàn)象不明顯；軟骨細胞核萎縮，細胞增生散在，簇狀增生少見，潮線完整，未見有軟骨蝕損；Masson染色全層沒鈣化軟骨藍綠染色保存較完整；滑膜未見明顯炎性細胞浸潤，滑膜上皮無增生及間質(zhì)水腫。治療Ⅰ組關(guān)節(jié)軟骨變化基本同模型組。治療Ⅲ組介于模型組、對照組之間，較對照組退變重。

2.2 血液流變學檢測結(jié)果

全血黏度低切，模型組與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組與對照組、治療Ⅱ組、治療Ⅲ組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與治療Ⅰ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），正常組、對照組和各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；全血黏度中切，模型組與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與治療Ⅱ組、治療Ⅲ組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），正常組、對照組和各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；全血黏度高切，模型組與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），模型組與治療Ⅱ組、治療Ⅲ組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與對照組、治療Ⅰ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），治療Ⅰ組和治療Ⅱ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。全血還原黏度低切，模型組與對照組、治療Ⅱ組、治療Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；全血還原黏度中切，模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），模型組和對照組及各治療組間比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），正常組、對照組和各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；全血還原黏度高切，模型組與對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。血漿黏度，對照組與治療Ⅰ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療Ⅰ組和治療Ⅱ組、治療Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。紅細胞聚集指數(shù)，模型組和對照組、治療Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表1。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）實驗動物模型的建立是研究OA病理機制及防治的必要手段，經(jīng)大量的實驗研究證實，誘發(fā)模型中，Hulth造模方法成功率較高，造模術(shù)后5 d即有軟骨退變出現(xiàn)，術(shù)后6周即可獲穩(wěn)定OA[3]。本實驗采用改良Hulth造模方法，唯一區(qū)別于Hulth的方面在于，只是切斷前交叉韌帶，而不是將前后交叉韌帶都切斷。這樣做使實驗動物膝關(guān)節(jié)尚存一定的穩(wěn)定性，不致于加重對膝關(guān)節(jié)的破壞。本實驗造模方法較Hulth造模法操作簡單、創(chuàng)傷小，通過手術(shù)造成的膝關(guān)節(jié)長期慢性應(yīng)力失常，最終發(fā)展為膝OA。此模型導致軟骨退變基本符合臨床上的發(fā)生機制。同時為了縮短動物模型制作期，根據(jù)臨床上超疲勞活動容易提前出現(xiàn)OA的發(fā)病特點[4]，對模兔采用單籠喂養(yǎng)，使之有一定的活動范圍，并每日驅(qū)趕動物以增加術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)的磨損及負重機會。通過觀察實驗兔的一般情況，發(fā)現(xiàn)模型組家兔均有不同程度的左膝關(guān)節(jié)跋行、關(guān)節(jié)活動范圍受限及關(guān)節(jié)畸形等表現(xiàn)，與OA患者的臨床癥狀與體征相似；同時本實驗模型組組織形態(tài)學及檢測指標來看，也證實術(shù)后其軟骨退變己非常明顯，與臨床骨關(guān)節(jié)炎的病理改變相似，從而證實了改良Nulth造模在本次實驗應(yīng)用的可靠性及可行性。

表1 6組血液流變學檢測結(jié)果比較（±s）

表1 6組血液流變學檢測結(jié)果比較（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與治療Ⅱ組比較，&P<0.05；與治療Ⅲ組比較，#P<0.05；與治療Ⅰ組比較，$P<0.05

組別 只數(shù) 全血黏度（mPa·s）低切 中切 高切全血還原黏度（mPa·s）低切 中切 高切 血漿黏度（mPa·s）紅細胞聚集指數(shù)正常組模型組對照組治療Ⅰ組治療Ⅱ組治療Ⅲ組666666 6.16±0.81**8.30±0.91 6.75±0.75△△7.06±0.68▲6.21±1.09▲▲6.31±0.83▲▲3.91±0.53**4.64±0.42 4.14±0.25△4.21±0.20 3.82±0.47▲▲3.84±0.37▲▲3.25±0.43**3.81±0.33 3.50±0.17 3.51±0.18&3.16±0.13▲▲3.20±0.29▲▲14.21±3.70 15.94±2.32 12.61±1.11△13.43±1.02 12.97±1.96▲12.73±1.83▲7.18±0.70*8.06±0.91 6.71±0.27△△6.83±0.34▲▲6.87±0.91▲▲6.90±0.58▲▲5.69±0.71 5.84±0.32 5.26±0.11△5.19±0.24▲5.23±0.64▲5.47±0.44 1.20±0.06 1.19±0.08 1.19±0.02$1.28±0.14
.14±0.07 1.12±0.06 1.90±0.11 2.19±0.24 1.92±0.14△2.01±0.15 1.96±0.24 1.91±0.22▲

OA在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中歸屬痹病之骨痹范疇。近年來，中藥在防治OA的實驗研究方面取得了很大進展，葉俊星等[5]用骨痛膠囊治療兔OA,證明骨痛膠囊內(nèi)服能有效的降低兔膝關(guān)節(jié)骨內(nèi)高壓，明顯改善骨髓內(nèi)血液流變學狀態(tài)。童敏等[6]運用骨康合劑對兔膝OA治療，結(jié)果顯示骨康合劑能通過改善骨關(guān)節(jié)炎血流動力學和血液流變學狀態(tài)，防止并行性改變。陳飛雁等[7]在觀察威靈仙注射液對骨關(guān)節(jié)炎模型動物關(guān)節(jié)軟骨膠原表型的作用中發(fā)現(xiàn)，威靈仙組能夠延緩異常膠原表達的出現(xiàn)，有效緩解基質(zhì)膠原降解破壞的程度。胡敏等[8]研究益氣通絡(luò)方對兔軟骨細胞活性及代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)益氣通絡(luò)方通過阻斷分解代謝細胞因子，防止膠原纖維轉(zhuǎn)型而促進細胞增殖。

桑生除痹合劑采用深圳市平樂骨傷科醫(yī)院國家級名老中醫(yī)郭春園教授的經(jīng)驗方，經(jīng)本院制劑車間按現(xiàn)代工藝生產(chǎn)的治療骨性關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗方，經(jīng)多年使用收到較好的效果。功能補腎健骨、化痹止痛，主要用于治療骨性關(guān)節(jié)炎的筋骨痿軟、腫脹疼痛等癥。從關(guān)節(jié)軟骨的退變來看，模型組關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴重，對照組和治療組均顯示存在軟骨增生、龜裂、局部缺損，但經(jīng)藥物治療，對照組、治療Ⅱ組、治療Ⅲ組退變程度明顯小于模型組，表明桑生除痹合劑可以減少或阻斷軟骨的丟失，修復損害的軟骨。

現(xiàn)代研究認為滑膜炎癥在OA的發(fā)病中起著重要的作用，蘇友新等[9]的實驗顯示，壯骨健膝顆粒對OA的療效與其能降低關(guān)節(jié)滑液NO水平有關(guān)。實驗中組織學觀察見模型組滑膜充血水腫甚至增生，關(guān)節(jié)囊肥厚、增生、粘連，滑膜炎性表現(xiàn)嚴重。而治療組的炎癥細胞浸潤明顯低于模型組，證實桑生除痹合劑可以作用于軟骨及滑膜細胞，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕滑膜炎癥，增加軟骨細胞的代償能力，達到防治OA的效果。在實驗中觀察到治療Ⅱ組、治療Ⅲ組的家兔關(guān)節(jié)軟骨面雖也有粗糙，但裂隙表淺，細胞增生散在，簇狀增生少見，且未見軟骨蝕損，明顯優(yōu)于模型組。筆者認為桑生除痹合劑可以增加軟骨細胞的代償能力，調(diào)整軟骨細胞的代謝向正常軌道轉(zhuǎn)換，進而促進軟骨機制中的代謝成分向正常方向改變，并且還可提高細胞的耐受力，對軟骨的降解起一定的緩解作用，具有良好延緩軟骨退變的作用。

從基質(zhì)著色改變方面觀察，模型組動物開始即有基質(zhì)著色的淺弱和不均，表現(xiàn)更為嚴重，在有些部位則全部丟失，對照組、治療Ⅱ組、治療Ⅲ組也有著色的減少，但減少程度輕，治療Ⅱ組趨于正常。治療組在丟失嚴重的部位見到軟骨細胞周圍的濃染，說明軟骨細胞仍在旺盛地合成基質(zhì)，揭示用藥組的軟骨細胞受到藥物影響，具有更強、更持久的合成基質(zhì)的能力。本實驗表明桑生除痹合劑可以減少或阻斷軟骨片的丟失和刺激滑液分泌的途徑，修復損害的軟骨，延緩軟骨退變，對膝OA滑膜增生和炎細胞浸潤有抑制作用，對OA病變發(fā)展有抑制作用，其中中劑量組療效更佳。

研究表明靜脈瘀滯、骨內(nèi)高壓可能是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的原發(fā)因素，骨內(nèi)微循環(huán)障礙是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。骨內(nèi)靜脈瘀滯首先是微循環(huán)瘀滯，從而引起骨內(nèi)高壓的主要因素已獲普遍認可。在形成骨內(nèi)高壓這一過程中，血液流變學異常表現(xiàn)為：血細胞壓積增加，全血和血漿比黏度增加，血漿纖維蛋白原增加，凝血速度加快，紅細胞和血小板在血漿中電泳緩慢，紅細胞沉降率加快。由于這些變化，使血液運行不暢，易致血栓形成、血管栓塞，靜脈回流受阻[10]。靜脈瘀滯引起骨內(nèi)壓力升高，進而導致骨內(nèi)血液灌注量減少，使骨內(nèi)呈貧血狀態(tài)，造成骨髓組織缺血、缺氧，酸性代謝產(chǎn)物聚積，滑膜也因關(guān)節(jié)內(nèi)高壓而使血流量減少，靜脈淤積導致滑膜分泌酸性滑液，微循環(huán)系統(tǒng)的局部反饋機制失調(diào)，毛細血管周圍肥大細胞釋放組織胺，血漿外滲，引起組織水腫及微循環(huán)血液的濃縮，血栓形成，從而導致血液灌注量進一步減小，骨內(nèi)壓和關(guān)節(jié)內(nèi)壓進一步升高，如此形成惡性循環(huán)[11]，不可避免地破壞局部組織的正常理化環(huán)境，從而導致關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。此外，局部營養(yǎng)障礙，可造成骨細胞壞死[12]。

從實驗結(jié)果看，全血黏度、全血還原黏度模型組和對照組、治療Ⅱ組、治療Ⅲ組間有顯著性差異，紅細胞聚集指數(shù)模型組和對照組、治療Ⅲ組間比較有顯著性差異，說明造模3個月后血液黏滯性增加，經(jīng)藥物干預后可明顯改善血液黏滯性，其中以高劑量組最佳，療效與劑量呈相關(guān)性。本實驗結(jié)果證實了桑生除痹合劑能顯著改善血液流變學狀態(tài)，從而達到保護關(guān)節(jié)軟骨、治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。

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