人腦膠質(zhì)瘤中HIF-1α、Ki-67的表達(dá)及其臨床意義

李 凈 ，喻 光

1.哈爾濱市胸科醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150056；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬一院，黑龍江齊齊哈爾 161041

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的35%～50%，其中惡性膠質(zhì)瘤約占60%。目前腦膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以放療、化療和生物治療等綜合療法，但療效仍不理想[1-2]。HIF-1α是在缺氧條件下，廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，與其相關(guān)的一些基因蛋白產(chǎn)物與腫瘤的血管生成、能量代謝、紅細(xì)胞生成、細(xì)胞存活、血管重塑以及血管舒縮反應(yīng)有關(guān)[3]，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。Ki-67是一種細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，多用于判斷腫瘤的惡性程度，也用于探討細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期與腫瘤生長方式、侵襲方式、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系[4-5]。本文通過對56例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本的免疫組化研究，探討HIF-1α及Ki-67抗原在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、兩者的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)選取2007～2010年黑龍江省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本56例。其中，男32例，女24例；平均年齡40.1歲。按照WHO（1993）神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ～Ⅱ級為低度惡性，Ⅲ～Ⅳ級為高度惡性。56例患者中，Ⅰ級11例、Ⅱ級23例、Ⅲ級19例、Ⅳ級3例。其中星型細(xì)胞瘤39例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤11例，室管膜細(xì)胞瘤3例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤3例。

1.2 試劑

S-P法免疫組化檢測試劑盒、氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、一抗鼠抗人單克隆抗體HIF-1α及兔抗人單克隆抗體Ki-67均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；多聚-L-賴氨酸溶液、磷酸鹽緩沖液粉劑、抗原修復(fù)液購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；蘇木素溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

均經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋、連續(xù)切片5張，S-P免疫組化染色（參照試劑盒操作說明書），DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素溶液復(fù)染，逐級脫水性樹脂封片，OLYMPUS顯微鏡下觀察。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

①HIF-1α陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒狀位于胞核或胞質(zhì)主要為核表達(dá)。隨機(jī)觀察5個高倍視野膠質(zhì)瘤細(xì)胞中陽性染色細(xì)胞所占的比例，陽性細(xì)胞數(shù)＜1%為陰性（-），陽性細(xì)胞數(shù) 1%～10%為弱陽性（+），11%～50%為中度陽性（++），＞50%為強(qiáng)陽性（+++）。②Ki-67蛋白的表達(dá)在細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色染色為陽性。采用Ki-67指數(shù)（Ki-67LI）表示細(xì)胞的增殖程度，即高倍鏡（×400）下每個視野數(shù)200個瘤細(xì)胞，計算其陽性細(xì)胞總數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及Spearsman相關(guān)分析等，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

HIF-1α陽性表達(dá)為細(xì)胞核染色，呈棕黃色或橙黃色，腫瘤壞死區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣表達(dá)明顯高于其他區(qū)域。在56例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的總陽性表達(dá)率為66.07%（37/56），其中低度惡性組Ⅰ～Ⅱ級為50.0%（17/34），高度惡性組Ⅲ～Ⅳ級為90.91%(20/22)。HIF-1α在高度惡性的腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)明顯高于低度惡性者，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 HIF-1α在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（例）

2.2 Ki-67在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

Ki-67陽性表達(dá)多數(shù)為細(xì)胞核著色，呈棕黃色，少數(shù)為較弱的細(xì)胞質(zhì)染色。在56例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中總陽性表達(dá)率為62.50%（35/56）。Ki-67指數(shù)分別為低度惡性組Ⅰ～Ⅱ級（5.18±7.65）、高度惡性組Ⅲ～Ⅳ級（20.57±7.83），Ki-67在高度惡性的腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)明顯高于低度惡性者，Ⅰ～Ⅱ級和Ⅲ～Ⅳ級間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 二者在腦膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)之間的關(guān)系及相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)分析統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，二者呈正相關(guān)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（rs=0.513，P＜0.01）。見表3。

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，為一種DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體內(nèi)，其活性受缺氧因素調(diào)節(jié)[6-7]。其α亞單位（HIF-lα）對HIF-1的功能起決定性作用。Jiang等[6]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞氧濃度降低時，HIF-1α蛋白水平呈指數(shù)增加。腫瘤的特征是腫瘤細(xì)胞的過度生長從而導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量的增加，造成瘤體內(nèi)缺氧環(huán)境的形成。而腫瘤的缺氧狀態(tài)可誘導(dǎo)HIF-1α等細(xì)胞因子釋放，體現(xiàn)為在腫瘤中表達(dá)增加[8]。研究表明HIF-1α細(xì)胞因子過度表達(dá)可以與其下游基因中的共有序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上增加VEGF的表達(dá)可以增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平。在實(shí)體瘤中表現(xiàn)為增加缺氧區(qū)域血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的繼續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移，并與腫瘤的細(xì)胞代謝、壞死及放化療抵抗等方面有關(guān)。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果表明HIF-1α因子在腦膠質(zhì)瘤中呈陽性表達(dá)，并且隨著腫瘤惡性程度的升高，陽性表達(dá)率升高，在高度惡性組與低度惡性組中表達(dá)的差異有顯著性。在腫瘤壞死區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣表達(dá)明顯，提示在腦膠質(zhì)瘤壞死區(qū)、浸潤邊緣區(qū)瘤體內(nèi)的乏氧情況更加嚴(yán)重；高度惡性的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖快，相對低度惡性的乏氧情況更加嚴(yán)重。

表2 Ki-67在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（±s）

表2 Ki-67在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（±s）

注：Ki-67LI為Ki-67指數(shù)

t Ki-67 LI 5.18±7.65 20.57±7.83組織級別 n 34 22 P值Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ8.0150.000

表3 HIF-1α的表達(dá)與Ki-67相關(guān)性

Ki-67是細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原。存在細(xì)胞周期的G1、S1、G2、M期，是應(yīng)用廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記，可用于判斷腫瘤的等級、增生程度以及臨床預(yù)后[9]。Ki-67的表達(dá)率超過20%的患者的病死率是其低于20%患者的2.2倍[10]。在本研究中，Ki-67在各級膠質(zhì)瘤中均可見陽性表達(dá)，其在高惡性級組別腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)率顯著高于低惡性級別組，說明隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度增加，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長分裂速度和增殖潛能增加。Ki-67指數(shù)（Ki-67LI）是反應(yīng)腫瘤細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。本研究顯示Ki-67LI與腫瘤惡性度呈正相關(guān)。提示Ki-67可反映膠質(zhì)瘤的增殖狀態(tài)及惡性程度，可作為評價膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)及其判斷腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。

在腦膠瘤中，關(guān)于HIF-1α與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性方面文獻(xiàn)中報道較少。本研究結(jié)果顯示HIF-1α與Ki-67陽性表達(dá)呈正相關(guān)，差異具有顯著性。提示HIF-1α可誘導(dǎo)低氧環(huán)境下Ki-67等基因蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的增殖。兩者的詳細(xì)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HIF-1α可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤血管的形成。Ki-67可作為腦膠質(zhì)細(xì)胞增殖標(biāo)志物。兩者具有相關(guān)性，共同參與促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性增殖與侵襲性生長。兩者聯(lián)合檢測可作為反映腦膠質(zhì)瘤惡性程度的指標(biāo)，并判定腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，為腦膠質(zhì)瘤患者的治療提供參考。

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