毛細管電泳法同時測定鹽酸萘甲唑林滴鼻液中有機汞抑菌劑硫柳汞及其活性成分

徐 榮，李 岑，張福成，蔣 曄#(.空軍總醫(yī)院藥學部，北京 004;.河北醫(yī)科大學藥學院，石家莊 05007)

用于硫柳汞的分析方法主要有化學滴定法［1］、原子吸收光譜法［2，3］、比色法［4］及高效液相色譜法［5，6］等。采用化學滴定法、比色法分析硫柳汞的專屬性差且靈敏度較低;原子吸收法則需要在分析前對硫柳汞進行消解，操作復雜;高效液相色譜法分析硫柳汞是較為理想的方法，其具有靈敏度高，專屬性強等優(yōu)點。但是其無法與帶有相反電荷的鹽酸萘甲唑林同時檢測，且分析時間較長。目前，同時對滴鼻液中鹽酸萘甲唑林及硫柳汞進行檢測的研究未見報道。本文采用毛細管區(qū)帶電泳法同時分析測定了鹽酸萘甲唑林滴鼻液中的硫柳汞及帶有相反電荷的鹽酸萘甲唑林，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

儀器:高效毛細管電泳儀(北京彩陸科學儀器有限公司)、高壓電源(北京彩陸科學儀器有限公司)、紫外檢測器(北京彩陸科學儀器有限公司)、未涂層石英毛細管(50 μm i.d.×46 cm，有效長度37 cm，河北永年光導纖維廠)。藥品和試劑:鹽酸萘甲唑林對照品(批號:100111-200103)由中國藥品生物制品檢定所提供;硫柳汞為原料藥，純度 ＞99.5%;鹽酸萘甲唑林滴鼻液由天津金虹勝利藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號:100201、100202、100401);水為重蒸水;其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 電泳條件

運行緩沖溶液為20 mmol·L-1磷酸(pH=6.5);運行電壓20 kV;檢測波長240 nm;高度差進樣(20 cm)，進樣時間10 s;溫度25℃。每次開機后毛細管柱用0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液沖洗10 min，水沖洗10 min，運行緩沖液沖洗10 min，每次進樣前用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液、水和運行緩沖液分別沖洗3 min。所有溶液在使用前均用 0.45 μm的纖維樹脂膜濾過。

2.2 溶液配制

對照品溶液的配制:精密稱取鹽酸萘甲唑林對照品約80 mg，硫柳汞對照品約20 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別制成8.14 mg·mL-1和1.96 mg·mL-1的溶液作為對照品儲備液。供試品溶液:鹽酸萘甲唑林滴鼻液制劑可作為供試品溶液直接進樣進行分析，不需任何處理。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

在“2.2”項電泳條件下，空白輔料、混合對照品和供試品溶液色譜圖見圖1。由圖可知，輔料中其他成分對鹽酸萘甲唑林和硫柳汞檢測無干擾，且待測組分離度良好。

圖1 空白輔料、混合對照品及供試品的電泳圖Fig 1 Electropherograms of blank excipients，mixed reference substance and sample

2.4 線性關系

分別精密量取鹽酸萘甲唑林和硫柳汞對照品儲備液5 mL和0.5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成1號混合對照品溶液;再從1號工作液中量取5 mL置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得2號工作液，依此法對倍稀釋得3、4、5號系列標準溶液。按“2.2”項下電泳條件進樣，記錄色譜峰面積，以對照品的峰面積A對濃度C進行線性回歸，鹽酸萘甲唑林和硫柳汞的回歸方程分別為A=2.70×105C-9.80×102和 A=1.44×102C+29.5。結果表明:鹽酸萘甲唑林和硫柳汞分別在 0.122～3.87 mg·mL-1和 6.15～196 μg·mL-1的濃度范圍內線性關系良好，r2分別為 0.9997和0.9993。鹽酸萘甲唑林和硫柳汞的檢測限分別為7 μg·mL-1和 2 μg·mL-1;定量限分別為24.0 μg·mL-1和6.15 μg·mL-1。

2.5 加樣回收率

精密量取3份已知含量的樣品，分別精密加入高、中、低3個濃度的對照品溶液，加水稀釋至刻度。照“2.2”項下的方法操作，3個濃度的回收率結果見表1。

2.6 重現(xiàn)性、精密度及穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液(批號:100202)，連續(xù)進樣5次，依法測定峰面積。結果鹽酸萘甲唑林和硫柳汞的RSD分別為2.1%和2.6%。精密稱取同一批樣品(批號:100202)6份，按“2.2”項下條件測定，結果鹽酸萘甲唑林和硫柳汞的RSD分別為1.5%和2.0%。取同一批供試品溶液(批號:100202)，在室溫下放置，分別于 0、1、2、4、6、8 h時測定含量。結果樣品含量均無明顯變化，鹽酸萘甲唑林和硫柳汞峰面積的RSD分別為1.6%和2.1%。

表1 回收率實驗結果(n=3)Tab 1 Results of recovery test(n=3)

2.7 樣品含量測定

取3批供試品溶液，按2.2項下電泳條件進樣，計算鹽酸萘甲唑林和硫柳汞的含量，結果見表2。

3 討論

鹽酸萘甲唑林滴鼻液是一種用于過敏性及炎癥性鼻充血、急慢性鼻炎的臨床常用藥物，其有效成分為鹽酸萘甲唑林(naphazoline hydrochloride)，其檢測已有較多報道［7-9］。為了保證制劑多次使用后的安全性和穩(wěn)定性，制劑處方中含有少量硫柳汞(thimerosal)作為防腐劑。硫柳汞是一種含乙基汞的有機汞化合物，雖然長期以來一直被廣泛用做生物制品及藥物制劑包括許多疫苗的防腐劑，但由于有機汞的毒性問題越來越受到人們的關注，且硫柳汞在光照及其他條件下有可能降解或不穩(wěn)定［7］，濃度不足也會影響到其抑菌性能，因此，為了更好的控制滴鼻液的質量，對藥用制劑中硫柳汞含量進行檢測及控制是非常必要的。在實驗條件下，鹽酸萘甲唑林和硫柳汞分別在電滲流前后出峰，達到很好的分離，且在240 nm的檢測波長下，檢測靈敏度適于2種物質的同時檢測。該方法方便、快速，全部分析過程在5 min內完成，并且具有專屬性強、低消耗、環(huán)境友好等優(yōu)勢，是一種可應用于鹽酸萘甲唑林滴鼻液質量控制及抑菌劑限量的新方法。

表2 鹽酸萘甲唑林滴鼻液中鹽酸萘甲唑林及硫柳汞含量測定結果(n=3)Tab 2 Determination results of contents of naphazoline hydrochloride and thimerosal in Naphazoline Hydrochloride nasal drops(n=3)

3.1 緩沖鹽pH的影響

考察了磷酸鹽緩沖體系 pH 值分別為 5.5、6、6.5、7、7.5、8時鹽酸萘甲唑林和硫柳汞的分離情況以及檢測的靈敏度等參數(shù)。實驗發(fā)現(xiàn)，當pH值為5.5時，硫柳汞的響應值相對較低，峰形也較差，這可能跟硫柳汞在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定有關。隨著pH值增加，響應值增加，同時電滲流的遷移速度加快，2種物質分別在電滲流前后出峰。但 pH值越大，電流越大，產(chǎn)生的焦耳熱增多，噪音增大。實驗選擇pH值為6.5，此時緩沖液具有較好的緩沖能力，2種物質的分離度和遷移時間都比較適宜，且電流大小適當。

3.2 緩沖鹽濃度的影響

實驗考察了緩沖溶液 pH=6.5時，不同濃度的磷酸二氫鈉(10、20、30 mmol·L-1)對分離和檢測能力的影響。結果表明，隨著緩沖鹽濃度增加，電滲流遷移速度加快，樣品的遷移時間逐漸縮短，且增加緩沖鹽的濃度，電流過大，基線不穩(wěn)，不利于分離測定。綜合考慮，選擇20 mmol·L-1為緩沖鹽的最佳濃度。

3.3 運行電壓的考察

考察了電壓為10～25 kV時對分離效果的影響。實驗表明，隨著電壓的增加，出峰時間縮短，峰形尖銳，20 kV時分離最佳，峰形較好。當電壓大于20 kV時，基線不穩(wěn)，分離度下降。因此選擇最佳運行電壓為20 kV。

3.4 檢測波長的選擇

由于制劑處方中作為防腐劑的硫柳汞含量較低，其含量相對主成份鹽酸萘甲唑林來說，相差1個數(shù)量級，因此本實驗未采用鹽酸萘甲唑林的最大吸收波長作為檢測波長，而選擇了240 nm進行檢測，該波長為硫柳汞的最大吸收波長，提高了低濃度的硫柳汞檢測的靈敏度同時也滿足了檢測鹽酸萘甲唑林的靈敏度要求。

3.5 關于硫柳汞的使用安全

硫柳汞作為防腐劑的應用已具有60多年的歷史。但其毒性作用目前還在爭論之中。硫柳汞化學結構中含有乙基汞(其化學結構為乙基汞硫水楊酸鈉)，長期以來一直被廣泛用做生物制品及藥物制劑包括許多疫苗的防腐劑，雖然1930年上市時的數(shù)據(jù)表明低劑量的硫柳汞在人體及動物實驗上并無明顯傷害，但隨著1950年日本水俁地區(qū)有機汞中毒事件的發(fā)生，有機汞的毒性問題受到人們的關注，特別是1970年，伊拉克發(fā)生了因含有機汞殺蟲劑污染稻米而造成數(shù)千人死亡事件，有機汞化合物的使用和污染問題成為關注的課題。硫柳汞在一定條件下可降解，不僅降低其抑菌性能，同時降解產(chǎn)物也會對人體安全帶來危害。世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國兒科協(xié)會(AAP)、美國公共衛(wèi)生署(PHS)等機構已啟動減少和消除疫苗中使用硫柳汞的計劃，由此可見關于硫柳汞的使用安全越來越受到重視，對于制劑中硫柳汞的使用及含量控制也有待于進一步研究。

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