大蒜素對(duì)植煙土壤酶活性的影響

蘇循發(fā)，龔道新,2，項(xiàng)裕昆，謝 慧

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

土壤酶是土壤的重要組成部分，土壤中大量的生化過(guò)程都是在它們的參與下完成的。在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)等過(guò)程中，土壤酶起到表征物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化強(qiáng)度的作用。因此，土壤酶可作為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警和敏感指標(biāo)[1]。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的大量使用勢(shì)必對(duì)土壤質(zhì)量造成一定影響，因此，農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)必不可少，土壤酶活性是農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一[2]。大蒜素作為新型殺菌劑生物農(nóng)藥，對(duì)煙草上青枯菌和黑脛病菌有良好的抑制作用，大蒜素在煙田中的施用同樣會(huì)對(duì)植煙土壤酶活性有影響。有關(guān)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)土壤酶活性的影響已有許多報(bào)道[3-5]，但關(guān)于大蒜素對(duì)植煙土壤中蔗糖酶、脲酶和過(guò)氧化氫酶活性影響的研究在國(guó)內(nèi)外卻未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備：電子天平、恒溫水浴鍋、人工氣候箱、WFJ型721分光光度儀、酸式滴定管、WHY-2型水浴恒溫振蕩器、微量噴霧器等。

藥品和試劑：88.4%大蒜素標(biāo)準(zhǔn)樣品；30%H2O2、98%濃 H2SO4、0.1 mol/L KMnO4溶液（用草酸鈉標(biāo)定）、3,5-二硝基水楊酸、pH值6.7的檸檬酸－磷酸緩沖溶液、pH值5.5的磷酸緩沖溶液、NaOH、酒石酸鉀鈉、蔗糖、葡萄糖、結(jié)晶酚、尿素、苯酚鈉溶液、次氯酸鈉、硫酸胺等。以上試劑均為分析純。

氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.471 7 g硫酸銨溶于水并定容至1 000 mL，制得含0.1 mg/mL氮的標(biāo)準(zhǔn)液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.550 5 g葡萄糖溶于水，定容至1 000 mL，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2 試驗(yàn)材料

土壤樣品取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗(yàn)基地的煙田，土壤為河潮土。土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干，去除砂石、植物根系等非土壤部分，研碎過(guò)20目篩后備用。供試土壤的理化性質(zhì)如下：土壤有機(jī)質(zhì)含量2.31%，pH值6.2，土壤粘粒、粉粒和沙粒含量分別為24.5%、48.3%和27.2%。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取已制備好的土壤樣品200.0 g若干份，計(jì)算出使土壤中大蒜素的含量分別為0（CK）、1.0、10.0和50.0 mg/kg，將所配制的大蒜素溶液用微量噴霧器均勻地噴灑于土樣中（重復(fù)3次），邊噴邊用玻璃棒攪動(dòng)，噴完后，將土壤反復(fù)過(guò)10目篩，直至均勻。然后，根據(jù)土壤重量加入蒸餾水至土/水=1/1.2，置于（25±1）℃人工氣候箱中培養(yǎng)，每天光照14 h，黑暗時(shí)間為10 h，培養(yǎng)過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充水分，切忌干涸。重復(fù) 3 次。在培養(yǎng) 1、3、5、7、10、20、30 d 后取土壤樣品檢測(cè)其中蔗糖酶、脲酶和過(guò)氧化氫酶的活性。

1.4 植煙土壤中酶活性的測(cè)定方法

1.4.1 蔗糖酶活性的測(cè)定[6]其測(cè)定原理為：蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，而葡萄糖能與3,5-二硝基水楊酸生成橙色物質(zhì)，可在分光光度計(jì)上508 nm處比色測(cè)定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：吸取配置好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 移至 50 mL 容量瓶，分別加蒸餾水 2、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL，再加 3 mL 3,5-二硝基水楊酸，沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容。將顯色液在分光光度計(jì)上于508 nm處比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.001 C-0.004 3，相關(guān)系數(shù)R為0.999 6。

測(cè)定方法：稱取5 g上述培養(yǎng)的土壤樣品，置于50 mL三角瓶中，加入15 mL 8%蔗糖溶液，5 mL pH值5.5的磷酸緩沖液和5滴甲苯搖勻混合后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后取出，迅速過(guò)濾，從中吸取濾液l mL，注入50 mL容量瓶中，加3 mL 3,5-二硝基水楊酸，沸水浴中加熱5 min，冷卻并定容，在分光光度計(jì)上于508 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線算出葡萄糖含量。蔗糖酶活性以24 h后每克干土所能催化生成的葡萄糖的毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性1 U=1 mg葡萄糖/g干土·24h。

1.4.2 脲酶活性的測(cè)定[6]其測(cè)定原理為：脲酶能酶促尿素生成氨、二氧化碳和水。氨能與“苯酚—次氯酸鈉”在堿性條件下生成藍(lán)色的靛酚，后者可在分光光度計(jì)上630 nm處比色測(cè)定。

氮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：準(zhǔn)確吸取5.00 mg/mL的氮溶液10.00 mL，定容至100 mL，即稀釋了10倍，吸取 0、2、4、6、8、10 mL 移至 50 mL 容量瓶，加水至20 mL，再加入4 mL 1.35 mol/mL苯酚鈉，仔細(xì)混合，加入3mL 0.9%次氯酸鈉，充分搖蕩，放置l h，顯色后用蒸餾水稀釋至刻度。將顯色液在分光光度計(jì)上于630 nm處進(jìn)行比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.044 7 C+0.009，相關(guān)系數(shù)R為0.995 9。

測(cè)定方法：稱取相當(dāng)于5 g干土，置于50 mL的三角瓶中，加入l mL甲苯。15 min后加入10 mL 10%的尿素溶液和20 mL pH值6.7的檸檬酸鹽緩沖液，搖勻后在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，過(guò)濾，從中取3 mL濾液注入50 mL容量瓶中，然后加蒸餾水及4 mL苯酚鈉溶液和3 mL 0.9%次氯酸鈉溶液，放置l h后用蒸餾水定容至刻度，進(jìn)行比色，測(cè)定其吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出NH3-N含量。脲酶活性以24 h后每克土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示。脲酶1 U=1 mg NH3-N/g干土·24h。

1.4.3 過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定[7]其測(cè)定原理為：過(guò)氧化氫酶能酶促過(guò)氧化氫分解為水和分子氧。向土壤中加入過(guò)量的過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化氫與土壤相互作用后，未分解的過(guò)氧化氫可用高錳酸鉀滴定，這樣就可以求出酶促反應(yīng)所用過(guò)氧化氫的量，從而測(cè)定出土壤中過(guò)氧化氫酶的活性。

測(cè)定方法：取2 g上述培養(yǎng)土壤，置于100 mL三角瓶中，并注入40 mL蒸餾水和5.0 mL 0.3%過(guò)氧化氫溶液。將三角瓶放在恒溫水浴振蕩器上振蕩20 min。而后加入5 mL 3 mol/L硫酸，以穩(wěn)定未分解的過(guò)氧化氫。再將瓶中懸液用慢速型濾紙過(guò)濾。然后吸取25 mL濾液，用0.l mol/L高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點(diǎn)，消耗的高錳酸鉀量記為B。另取5.0 mL 0.3%過(guò)氧化氫與40 mL蒸餾水以及5 mL 3 mol/L硫酸混合，用0.l mol/L高錳酸鉀測(cè)定，消耗的高錳酸鉀量記為A。A-B所得的差乘以高錳酸鉀滴定度的校正值T，即為土壤過(guò)氧化氫酶的活性：（AB）×T。以每克土壤消耗的0.1 mol/L高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜素對(duì)植煙土壤中蔗糖酶活性的影響

從圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大蒜素對(duì)植煙土壤中蔗糖酶活性的影響表現(xiàn)為“抑制（處理后前7 d）→激活（處理后第10天至第30天）”的過(guò)程。處理后前7 d，大蒜素對(duì)植煙土壤中蔗糖酶都表現(xiàn)出抑制作用，且大蒜素濃度越大，抑制作用越明顯，7 d時(shí)50.0 mg/kg的大蒜素對(duì)蔗糖酶的抑制率達(dá)到了89.32%。從處理后的第10天開始，各濃度的處理都開始表現(xiàn)出激活作用，激活作用的大小與大蒜素濃度的高低呈正相關(guān)，直到第30天，這種激活作用也未消失。這可能是由于高濃度大蒜素施用初期對(duì)土壤中可產(chǎn)生蔗糖酶的微生物有一定的抑制作用，但這類微生物很快適應(yīng)，并能利用大蒜素作為碳源和能源，使蔗糖酶活性很快恢復(fù)或增強(qiáng)。

圖1 大蒜素對(duì)植煙土壤中蔗糖酶活性的影響

2.2 大蒜素對(duì)植煙土壤中脲酶活性的影響

由圖2可知，大蒜素對(duì)植煙土壤中脲酶活性的影響表現(xiàn)出先激活再抑制再激活的作用。但低濃度的大蒜素對(duì)脲酶活性的激活與抑制作用均弱于高濃度的大蒜素。在處理后的前3 d各濃度的大蒜素對(duì)脲酶均表現(xiàn)出激活作用，3～10 d表現(xiàn)為抑制作用，隨后又轉(zhuǎn)為激活作用，20 d時(shí)50.0 mg/kg的大蒜素對(duì)脲酶的激活作用達(dá)到了31.35%。30 d后激活作用基本上消失，可以回復(fù)到正常水平。

圖2 大蒜素對(duì)植煙土壤中脲酶活性的影響

2.3 大蒜素對(duì)植煙土壤中過(guò)氧化氫酶活性的影響

由圖3可知，處理初期各濃度的大蒜素均能夠激活過(guò)氧化氫酶，并且隨著濃度的升高其活性增強(qiáng)。從處理后第5天至處理結(jié)束，各濃度的大蒜素對(duì)過(guò)氧化氫均表現(xiàn)為抑制作用，且各濃度的大蒜素的抑制率基本相等，隨著時(shí)間的推移抑制作用逐漸減弱，直至恢復(fù)到對(duì)照水平。這可能是因?yàn)槌跗诖笏馑乜梢源碳の⑸锎x產(chǎn)生更多的過(guò)氧化氫酶，而隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤中通氣狀況有所惡化，加之可提供土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有毒有害代謝產(chǎn)物的積累等，使土壤中過(guò)氧化氫酶的活性下降[8]。

圖3 大蒜素對(duì)植煙中土壤中過(guò)氧化氫酶活性的影響

3 結(jié)論

（1）大蒜素對(duì)土壤中蔗糖酶的影響較大，且濃度越高影響越大?？傮w表現(xiàn)為前期抑制，后期激活的過(guò)程。

（2）大蒜素對(duì)土壤脲酶的影響總體表現(xiàn)為激活作用，但在3～10 d有抑制作用，總體與大蒜素的濃度無(wú)明顯關(guān)系。

（3）大蒜素對(duì)過(guò)氧化氫酶的影響表現(xiàn)為“激活－抑制”過(guò)程，且各濃度的大蒜素對(duì)過(guò)氧化氫酶的影響基本相同。

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