大葉羊蹄甲中黃酮類化合物提取方法的初步研究

鐘 佳，馬金晶，羅 雯，宋 爽，葉艷青

(云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委－教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650521)

大葉羊蹄甲為豆科(Leguminosae)褐毛羊蹄甲屬(Bauhinia)植物的干燥藤莖，秋、冬季采收，除去側(cè)枝，切成厚片，干燥．具有清熱涼血、祛風(fēng)解毒、活血通經(jīng)、消腫止痛等功效［1］．關(guān)于羊蹄甲屬植物的研究文獻(xiàn)報(bào)道不多［2－4］，對(duì)于其中的黃酮類化合物的超聲提取研究未見報(bào)道．本文采用正交試驗(yàn)，分別用醇提法和超聲波提取大葉羊蹄甲中的黃酮類化合物，比較2種方法的提取效果及黃酮類化合物的含量，從而得到最佳條件［5－7］．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器和試劑

WFJ7200型分光光度計(jì)(尤尼柯 UNICO);AR224CN型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司);SP－752型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);電熱恒溫干燥箱(天津市津北真空儀器廠);SG3200HE型超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)．

大葉羊蹄甲原藥(購(gòu)于西雙版納傣族自治州民族醫(yī)藥研究所原藥材);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);乙醇(分析純)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 大葉羊蹄甲中黃酮類物質(zhì)的測(cè)定

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制．稱取120℃干燥恒重蘆丁100.8 mg，用60%微熱乙醇溶解，定容至100.00 mL，得質(zhì)量濃度為1.008 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液．分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)使用液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL于9只25 mL容量瓶中，加10 mL 30%乙醇，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min ，加1 mol/L NaOH溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置10～15 min，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=12.512X+0.015 3，R2=0.999 9．

2)樣品中總黃酮的測(cè)定方法．準(zhǔn)確吸取樣品液1．0 mL，置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，取2 mL于25 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測(cè)定吸光度．所測(cè)樣品吸光度值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算后，得出提取液總黃酮濃度，然后按下式計(jì)算提取率：

提取率(%)=(C×稀釋倍數(shù)×V)/W ×100%．

C：根據(jù)所測(cè)定的溶液的吸光度值，代入回歸方程計(jì)算出相應(yīng)的總黃酮含量;

W：實(shí)驗(yàn)稱取大葉羊蹄甲的質(zhì)量;

V：測(cè)定時(shí)大葉羊蹄甲的定容體積．

1．2．2 大葉羊蹄甲預(yù)處理

將大葉羊蹄甲用自來水快速?zèng)_洗干凈后，再用去離子水洗2～3次，置于烘箱中，于60～65℃烘5 h，取出冷卻后粉碎，過孔徑為0.301 mm的篩，將篩好的粉末置于干燥器中備用．

1．2．3 提取方法

1)醇提法．準(zhǔn)確稱取2．000 g大葉羊蹄甲粉末，加入一定體積的乙醇，進(jìn)行醇提回流，抽濾，定容，用分光光度法對(duì)其黃酮類物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定．取提取溫度，提取時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)，固液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，醇提法因素及水平設(shè)計(jì)見表1．

表1 醇提法因素水平設(shè)計(jì)

2)超聲提取法．準(zhǔn)確稱取2．000 g大葉羊蹄甲粉末，用乙醇浸泡24 h，在室溫下進(jìn)行超聲提取，抽濾，定容，用分光光度法對(duì)其黃酮類物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定．取超聲頻率，超聲時(shí)間，乙醇濃度，固液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，超聲波提取法因素及水平表設(shè)計(jì)見表2．

表2 超聲波因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2．1 醇提法提取效果

由表3可知，回流溫度的極差最大(1．31)，提取時(shí)間的極差最小(0．15)，根據(jù)極差分析表明，醇提法的因素影響大小依次為：回流溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞固液比＞提取時(shí)間．最后確定出最佳提取條件為：回流溫度為80℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，固液比1∶20，提取時(shí)間為1 h．該條件下黃酮提取率為11．81%．

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2．2 超聲提取法提取效果

由表4可知，固液比的極差最大(0．6)，超聲頻率的極差最小(0．11)，根據(jù)極差分析表明，超聲波因素影響大小依次為：固液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞超聲頻率．最后確定出最佳提取條件為：超聲頻率為500 W，超聲時(shí)間為15 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%，料液比為1∶15．該條件下黃酮提取率為14.56%．

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3 結(jié)論

1)經(jīng)過比較可知，在各種不同條件下，超聲提取法對(duì)大葉羊蹄甲中黃酮類物質(zhì)的提取率都比醇提法的高，且時(shí)間短，主要由于超聲的空化作用引起的機(jī)械力和熱作用．所謂超聲空化，就是一種超聲在液體內(nèi)形成空化泡的現(xiàn)象．空化泡在液體中迅速產(chǎn)生、長(zhǎng)大、壓縮、閉合、崩潰，這個(gè)運(yùn)動(dòng)過程不斷地快速重復(fù)，會(huì)產(chǎn)生瞬時(shí)高溫、高壓，并有強(qiáng)烈的沖擊波和高速射流伴隨產(chǎn)生，致使大葉羊蹄甲中的細(xì)胞壁破裂，從而加快了溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的速度，促進(jìn)細(xì)胞中的總黃酮類物質(zhì)直接、快速地向溶劑中溶解、轉(zhuǎn)移，并加快了轉(zhuǎn)化速度［8－10］．與醇提法的浸潤(rùn)、滲透、解吸、溶解、擴(kuò)散、置換等過程相比，超聲法的超聲空化作用大大加速了總黃酮類物質(zhì)的提取速度，縮短了提取時(shí)間，增加了大葉羊蹄甲中總黃酮類物質(zhì)提取率．

2)正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：超聲時(shí)間、超聲頻率、溶劑的不同濃度等都對(duì)超聲提取大葉羊蹄甲中總黃酮類物質(zhì)提取率有一定的影響．其超聲波因素影響大小依次為：固液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞超聲功率．用超聲提取法提取大葉羊蹄甲的黃酮類物質(zhì)，最佳的提取工藝是固液比為1∶15，乙醇濃度為90%，超聲時(shí)間15 min，超聲功率為500 W，在此條件下，得到黃酮的提取率為14．56%．

［1］云南省食品藥品監(jiān)督管理局．云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：傣族藥［S］．3版．昆明：云南科技出版社，2007．

［2］張群芳，宋爽，郭俊明，等．微波消解－原子吸收光譜法測(cè)定大葉羊蹄甲中的金屬元素［J］．云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，19(2)：119 －121．

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