宮頸癌組織中DNA甲基轉移酶1、3A 和3B mRNA的表達*

姜樹原 張顏波 隨 鑫 黃麗華 趙志英 邵 國,4

(1.包頭醫(yī)學院生物醫(yī)學研究中心 ，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2. 泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 山東 泰安 27100；3.包鋼醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010； 4.汕頭大學醫(yī)學院分析細胞學實驗室，廣東 汕頭 515041)

宮頸癌是在女性常見的惡性腫瘤，雖然90%的宮頸鱗癌和50%的宮頸腺癌都可以檢測到HPV DNA，但迄今為止宮頸癌發(fā)生的確切分子機制仍不清楚，已發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中多種腫瘤相關基因異常甲基化[1][2]。在人類的大多數(shù)的腫瘤當中，都有DNA甲基化異常的存在。人類腫瘤當中,一般表現(xiàn)為整體DNA甲基化降低，并伴有特定基因區(qū)域的高甲基化。DNA甲基化降低會改變?nèi)旧w的結構而導致染色體不穩(wěn)定，而CpG島的高甲基化則發(fā)生在特定腫瘤相關基因并使其低表達或沉寂。DNA甲基化的改變可能可以作為癌癥風險評估、癌癥早期診斷和癌癥病人不良預后的標志。DNA的甲基化是靠DNA 甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT) 催化完成的。在Peter John研究小組的文章中指出，癌癥病人樣本中發(fā)現(xiàn)5/10的DNMT3A上調(diào)，6/10的DNMT1上調(diào)，8/10的DNMT3B上調(diào)。且DNMT3B上調(diào)的幅度最大，與對照相比，平均增加7.5倍。因此，DNMT3B在癌癥的發(fā)生中可能有重要作用[3]。本研究用real-time PCR技術檢測了宮頸癌及癌前病變組織中DNMT1、3A和3B mRNA mRNA的表達, 探討DNMT1、3A和3B mRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用, 以期進一步了解宮頸癌的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 標本及試劑

30例宮頸樣本均來自包頭醫(yī)學院附屬醫(yī)院的新鮮標本；RNeasy Mini Kit, QIAGEN; superscripⅡRT 酶(1 ×108U/ L ) , Invitrogen ; (10 mmol/ L、0. 25 mmol/ L),random引物(0. 5 g/ L) , The Brilliant. SYBR Green QPCR master mix(stratagene)；焦碳酸二乙酯(DEPC) ,Sigma ;瓊脂糖,Spanish；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 引 物

根據(jù)文獻和Genebank序列，用Primer premier 5.0軟件分別設計DNMT1、3A和3B及內(nèi)參GAPDH基因的引物。引物由上海生物公司合成，引物序列如下。

GAPDH F： 5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'；

GAPDH R： 5'-GGTCATTGATGGCAACAA-3'；

DNMT3A F : 5-GACAAGAATGCCACCAAAGC;

DNMT3A R: 5-CGTCTCCGAACCACATGAC;

DNMT1F：AACCTTCACCTAGCCCCAG；

DNMT1R：CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA；

DNMT3B F：AGGGAAGACTCGATCCTCGTC；

DNMT3B R： GTGTGTAGCTTAGCAGACTGG；

1.3 RT-PCR及real-time PCR

RT-PCR：用QIAGEN公司提供的RNeasy Mini Kit提取細胞總RNA,紫外分光光度計檢測RNA純度和含量。逆轉錄反應：在0.5ml Eppendorf管中加入總RNA 2 μg，random hexamer引物1 ul，用DEPC水補足12 μl。70 ℃，孵育10 min；立刻冰浴1 min。再加入5×RT反應緩沖液4 μl；dNTP(10mM)，1 μl；DTT(0.1M)，2 μl，混勻，42 ℃孵育5 min。隨后加入SuperscripⅡRT酶 1 μl，在42 ℃，反應50 min；70 ℃，反應15 min。得到cDNA產(chǎn)物-20 ℃保存。Real-time PCR：使用ABI的96孔板，每孔依次加入cDNA 1μl，2×mix 12.5 μl，3′和5′端引物(5μmol.L-1) 各1 μl，無菌水9.5 μl，在ABI 7900 real-time PCR反應儀上反應，每個樣本設3個復空。反應參數(shù)：94 ℃預變性3 min，再進行92 ℃，30 s；54.5 ℃，35 s；72 ℃，30 s(40 cycles)，最后72 ℃延伸5 min停止反應。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學處理

2 結 果

宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸中DNMT 1mRNA對GAPDH mRNA的相對豐度值分別是 0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04, 宮頸癌組織組織中與正常宮頸中DNMT 1表達有顯著差異(P<0.05)，而宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌組織和正常宮頸在DNMT 1表達上沒有顯著差異(P>0.05)(圖1)； 宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸中DNMT3A mRNA對GAPDH mRNA的相對豐度值分別是 0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三組在DNMT3A mRNA表達上有顯著性差異(P<0.05)(圖2)； 宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變和正常宮頸中DNMT 3B mRNA對GAPDH mRNA的相對豐度值分別是 0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04，宮頸癌組織組織中與正常宮頸中DNMT 3B表達有顯著差異(P<0.05)，而宮頸上皮內(nèi)瘤變與宮頸癌組織和正常宮頸在DNMT 3B表達上沒有顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖1 DNMT 1 mRNA 對GAPDH mRNA相對豐度圖

CC：宮頸癌組織；CIN：宮頸上皮內(nèi)瘤變；Normal：正常宮頸(*P<0.05,n=10)

圖2 DNMT 3A mRNA 對GAPDH mRNA相對豐度圖

CC：宮頸癌組織；CIN：宮頸上皮內(nèi)瘤變；Normal：正常宮頸(*P<0.05,n=10;#P<0.05,n=10)

圖3 DNMT 3B mRNA 對GAPDH mRNA相對豐度圖

CC：宮頸癌組織；CIN：宮頸上皮內(nèi)瘤變；Normal：正常宮頸(*P<0.05,n=10)

3 討 論

DNA甲基化與腫瘤密切相關，腫瘤的DNA甲基化改變表現(xiàn)為總體的甲基化水平降低與特定基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平升高，特定基因主要為抑癌基因與修復基因，它們的甲基化導致抑癌基因沉默與修復基因失活,造成腫瘤抑制喪失與基因損傷增加; 而總體地低甲基化使癌基因活化和使染色體不穩(wěn)定。催化DNA中胞嘧啶發(fā)生甲基化的酶DNMT到目前為止有3種DNMT，它們是DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B和DNMT 3L[4]。DNMT1是持續(xù)性甲基化酶，其底物是半甲基化的DNA 。DNMT2的功能尚不明朗，有報道稱它不甲基化DNA而是甲基化天冬氨酸t(yī)RNA。DNMT3A和DNMT3B有從頭催化DNA甲基化的能力。DNMT3L單獨沒有催化能力，但它可以和DNMT3A和DNMT3B相互作用，調(diào)節(jié)其活性[5]。

與Peter John研究小組的研究結果相符[3]，本研究結果顯示DNMT1、3A和3B mRNA表達率從正常宮頸、CIN至宮頸癌呈逐漸升高趨勢, 并且正常宮頸和宮頸癌差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而只有DNMT3A mRNA正常宮頸、CIN和宮頸癌中逐漸升高并具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而DNMT1和DNMT3B在CIN中的表達高于正常宮頸且低于宮頸癌，但沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。趙先蘭等報道DNMT1 mRNA表達率從正常宮頸、CIN至宮頸癌呈逐漸升高趨勢, 差異有統(tǒng)計學意義(P< 0. 05)[6],雖然趙蘭先等使用的是原位雜交而我們使用的是real-time PCR的技術，并且我們研究的樣本數(shù)較少，但我們和趙蘭先等在DNMT1 mRNA表達率從正常宮頸、CIN至宮頸癌變化趨勢一樣的。由于我們使用的樣本較少，DNMT1和DNMT3B在CIN中的表達高于正常宮頸且低于宮頸癌，但沒有統(tǒng)計學意義，若增加樣本量，它們之間會有顯著性差異。因此本研究報道的DNMT1、3A和3B mRNA表達率從正常宮頸、CIN至宮頸癌的變化規(guī)律提示了DNMT在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要角色。

雖然我們研究結果顯示DNMT1、3A和3B可能都參與了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，但宮頸癌的發(fā)生可能有多種基因甲基化發(fā)生改變，特別是抑癌基因因甲基化而失活[7，8]，一些基因的異常甲基化，特別是在CIN中的異常，對于臨床上宮頸癌的防治有重要意義[9]。要明確DNMT1、3A和3B各自在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用，特別是它們在抑癌基因因甲基化中的作用，對于宮頸癌的治療有重要意義，而明確它們的作用則需要進一步深入研究。

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