大鼠聽覺發(fā)育中聽覺敏感度及時(shí)間分辨率的變化

余新 王堅(jiān) 殷善開

聽覺敏感度即聽敏度，是辨別不同頻率和強(qiáng)度聲音的能力。時(shí)間分辨率是聽覺系統(tǒng)對聲音信號(hào)快速變化做出反應(yīng)的能力，時(shí)間分辨率主要通過間隔探測實(shí)驗(yàn)來衡量，即測量受試者在一個(gè)連續(xù)的聲音中，探測出一個(gè)短暫的無聲間隔的能力。一般以能夠探測到的最短的無聲間隔的時(shí)程，即間隔閾值代表聽覺系統(tǒng)對時(shí)間的分辨能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以往通常采用電擊、飲食剝奪等方法建立條件反射以進(jìn)行行為學(xué)間隔測試，上述方法無法保證測試個(gè)體身體狀態(tài)的一致性從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，且相對殘酷，已逐漸被淘汰。聽覺驚跳反射前抑制試驗(yàn)近來以其簡單、無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)廣為運(yùn)用。聽覺驚跳反射(acoustic startle response, ASR)是指人或動(dòng)物對突然出現(xiàn)的強(qiáng)烈聲音刺激產(chǎn)生的防御性行為反射，表現(xiàn)為突然的面部、頸部和肢體骨骼肌的運(yùn)動(dòng)。驚跳反射前抑制(prepulse inhibition，PPI)是指在驚跳刺激(startle stimulus，SS)前適當(dāng)時(shí)間(因此稱為前刺激，prepulse stimulus，PS)給予一個(gè)一定時(shí)程和強(qiáng)度的閾下刺激(即不能引起驚跳反射的刺激)抑制驚跳反射，使驚跳反應(yīng)幅度減小，潛伏期延長的現(xiàn)象。PPI測試可用于觀察聽覺系統(tǒng)對前刺激處理的能力。

近期許多學(xué)者采用間隔抑制試驗(yàn)，即以鑲嵌在背景噪聲中的無聲間隔(silent gap)作為前刺激來研究受試動(dòng)物的時(shí)域處理能力[1]。不同時(shí)程的gap鑲嵌在60～75 dB的背景噪聲中，其后大約20～100 ms跟隨一個(gè)驚跳刺激，因?yàn)橹挥挟?dāng)動(dòng)物感受到gap才能對驚跳反射有明顯的抑制作用，因此，可以通過該方法測得受試動(dòng)物的前刺激抑制率或間隔閾值，從而對受試動(dòng)物時(shí)域處理能力進(jìn)行研究。

目前運(yùn)用gap-PPI測試手段研究大鼠時(shí)間分辨率發(fā)育與聽敏度發(fā)育的相關(guān)性仍較少。本試驗(yàn)運(yùn)用gap-PPI及ABR測試研究大鼠聽覺時(shí)間分辨率和聽敏度的發(fā)育及其相互關(guān)系。在gap-PPI測試中，以攜帶不同時(shí)程的gap作為驚跳反射前刺激，研究大鼠聽覺系統(tǒng)發(fā)育過程中時(shí)間分辨率的改變。攜帶gap的背景噪聲的頻率采用大鼠最敏感且發(fā)育最早的頻率，即8～32 kHz，并排除擴(kuò)大的頻率帶寬對間隔測試的影響。同時(shí)也采用1～48 kHz的背景噪聲作為對比，觀察大鼠發(fā)育過程中時(shí)間分辨率的變化及帶寬對其的影響。另外，為了排除PPI測試的經(jīng)驗(yàn)效應(yīng)對間隔閾值的影響，每只大鼠只進(jìn)行一次gap-PPI測試，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日齡為14、16、18、22、26、30、35天的新生SD大鼠各20只，共140只。雌雄不限，耳廓反射正常，耳鏡檢查排除外耳道耵聹栓塞及中耳感染。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 鹽酸氯胺酮注射液，2%鹽酸利多卡因注射液。TDT system 3、TDT ES1 揚(yáng)聲器、Startle reflex 軟件、Biosig 軟件、壓電轉(zhuǎn)換器和LP-4電熱毯、鐵籠大小7 cm×5 cm×5 cm (長×寬×高)(自制)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1各日齡實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為A、B兩組，每組10只。A組大鼠gap-PPI測試標(biāo)記gap的背景噪聲帶寬為1～48 kHz，B組大鼠的背景噪聲帶寬為8～32 kHz，背景噪聲的強(qiáng)度均為75 dB SPL。各日齡的兩組大鼠均先進(jìn)行ABR測試，然后進(jìn)行g(shù)ap-PPI測試。

1.2.2ABR測試 所有刺激信號(hào)的產(chǎn)生和誘發(fā)電位的記錄均由TDT system 3系統(tǒng)硬件和軟件完成。ABR閾值為1～48 kHz范圍內(nèi)各倍頻程點(diǎn)短純音的響應(yīng)閾值。短純音上升、下降時(shí)間為0.5 ms，時(shí)程為10 ms，刺激重復(fù)率為11.1次/秒。大鼠經(jīng)鹽酸氯胺酮肌肉注射麻醉后置于恒溫電熱毯上，保證大鼠體溫穩(wěn)定在37.5℃左右，1%利多卡因于大鼠的顱頂及兩側(cè)乳突皮下局部注射，記錄電極刺入顱頂皮下，參考及接地電極分別刺入左、右側(cè)乳突皮下。刺激聲從90 dB SPL開始，5 dB下降一檔，以剛剛誘發(fā)出可辨認(rèn)的波V的最小聲強(qiáng)值為ABR反應(yīng)閾值。

1.2.3gap-PPI測試 如圖1所示，聽覺驚跳反射的記錄在屏蔽隔聲室進(jìn)行，一次可同時(shí)測試多個(gè)動(dòng)物。其主要測試裝置為載有敏感壓電轉(zhuǎn)換器的鐵籠，鐵籠大小根據(jù)受試動(dòng)物大小而定，以適度限制動(dòng)物活動(dòng)為佳。驚跳刺激信號(hào)由TDT system 3系統(tǒng)(Tucker-Davis Technologies, TDT)硬件和軟件完成，并通過懸掛在鐵籠上方10 cm處的高頻揚(yáng)聲器傳出。當(dāng)動(dòng)物發(fā)生驚跳反射時(shí)，軀體運(yùn)動(dòng)通過垂直力作用于鐵籠，經(jīng)鐵籠底部的壓電傳感器輸出信號(hào)接入另一個(gè)實(shí)時(shí)處理系統(tǒng)(TDT)，經(jīng)過放大(10-100X)和濾過(10～300 Hz)，輸入到實(shí)時(shí)處理器中 (RP2.1, TDT)， ASR的峰峰值由基于TDT硬件的startle reflex軟件計(jì)算。在聽覺驚跳反射前抑制的記錄中，前刺激信號(hào)也由TDT system 3系統(tǒng)硬件和軟件完成，通過懸掛在鐵籠上方10 cm處的高頻揚(yáng)聲器傳出，前刺激的聽覺驚跳反射(acoustic startle response with prepulse，ASRp)的記錄和峰峰值計(jì)算和ASR的記錄方法一致。

圖1 聽覺驚跳反射前抑制模式圖[2]

在gap-PPI的記錄中，由一個(gè)高頻揚(yáng)聲器輸出驚跳刺激信號(hào)，另一個(gè)高頻揚(yáng)聲器輸出背景噪聲和gap。驚跳刺激信號(hào)為115 dB SPL (持續(xù)時(shí)間20 ms,上升/下降時(shí)間0.1 ms)，前刺激信號(hào)為插入在75 dB SPL背景噪聲中的不同時(shí)程無聲間隔(gap)，其時(shí)程分別為0、1、2、4、6、8、10、15、25、50、100 ms,上升/下降時(shí)間0 ms，0 ms的間隔測試為僅有驚跳刺激的測試，反映驚跳反射的基值。實(shí)驗(yàn)采用2個(gè)不同帶寬的背景噪聲，分別為1～48 kHz和8～32 kHz。實(shí)驗(yàn)間隔(inter-trial interval, ITI)為相鄰兩個(gè)驚跳刺激信號(hào)之間的間隔，在16～24 s之間，平均ITI為20 s，以避免前面刺激產(chǎn)生的不應(yīng)期對后面刺激的影響。另外，隨機(jī)變化的實(shí)驗(yàn)間隔較固定的間隔更少出現(xiàn)驚跳反射的適應(yīng)性，并可防止動(dòng)物產(chǎn)生期待情緒。單組實(shí)驗(yàn)流程包括：背景噪聲—插入gap—背景噪聲—驚跳刺激信號(hào)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)sigma state統(tǒng)計(jì)軟件分析。在研究聽敏度的發(fā)育中，以每組各時(shí)間點(diǎn)大鼠各頻率段的ABR閾值為自變量，日齡和頻率為兩個(gè)因素，進(jìn)行雙因素方差分析。文獻(xiàn)報(bào)道[3]大鼠在生后14天ABR才能夠引出，到第35天左右，聽敏度和成年鼠無差異，所以本實(shí)驗(yàn)將35天齡大鼠的ABR作為標(biāo)準(zhǔn)對照。故每個(gè)日齡大鼠的ABR閾值均與第35天的ABR閾值比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表示該日齡大鼠的聽敏度尚未發(fā)育成熟，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異則表示該日齡的聽敏度已經(jīng)發(fā)育成熟。間隔閾值(gap threshold)通過配對t檢驗(yàn)，比較各時(shí)程的gap(1、2、4、6、8、10、15、25、50、100 ms)引起的ASRp與ASR基值(gap為0 ms)而得，以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最短gap為間隔閾值。

PPI%是 ASRp和ASR的比值，可用于比較不同日齡大鼠在間隔探測中的表現(xiàn)。采用雙因素方差分析，比較日齡(7個(gè)水平,14、16、18、22、26、 30、 35天)和無聲間隔(10個(gè)水平,1、2、4、6、8、10、15、25、50、100 ms)雙因素的作用及可能相互作用，如果發(fā)現(xiàn)某一因素的顯著性作用后，再用兩兩比較的方法決定具有顯著作用的因素水平。

2 結(jié)果

2.1日齡增加對間隔閾值的影響 圖2為兩組大鼠在不同背景噪聲下的間隔閾值?？梢?，大鼠間隔閾值隨日齡增加而下降，表明隨著聽覺系統(tǒng)的發(fā)育，大鼠的時(shí)間分辨率增加，時(shí)域處理能力增強(qiáng)。另一方面，相對于8～32 kHz的背景噪聲，1～48 kHz背景噪聲時(shí)的間隔閾值明顯下降(P=0.013)，也證實(shí)了隨著攜帶gap的背景噪聲頻率帶寬的增寬或頻率的提高，時(shí)間分辨率越佳。

圖2 不同背景噪聲下兩組大鼠的間隔閾值

表1 各日齡組大鼠在兩種背景噪聲下不同無聲間隔時(shí)間的PPI%

注：在背景噪聲為1～48 kHz時(shí)，30天大鼠的時(shí)間分辨率與35天大鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在背景噪聲為8～32 kHz時(shí)，30天大鼠時(shí)間分辨率與35天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.138)

表2 不同日齡大鼠的各頻率ABR閾值(dB SPL)

注：雙因素方差分析示1、2和4 kHz頻率的ABR閾值第26天與35天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P(1 kHz)=0.098;P(2 kHz)=1.000;P(4 kHz)=0.715]；16和 32 kHz的ABR閾值第22天與35天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P(16 kHz)=0.072;P(32 kHz)=0.920]；8 和48 kHz的ABR閾值第18天與35天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P(8 kHz)=0.104;P(48 kHz)=0.527]。

2.2日齡增加對PPI%的影響 表1結(jié)果顯示在背景噪聲為1～48 kHz時(shí)，第30天大鼠的時(shí)間分辨率才發(fā)育成熟。當(dāng)背景噪聲為8～32 kHz時(shí)，雖然大鼠的間隔閾值提高，但同樣到第30天時(shí)，時(shí)間分辨率才發(fā)育成熟。不同日齡在不同背景噪聲下大鼠PPI%的變化趨勢，gap時(shí)程越長，PPI%越??；日齡增加，PPI%越小。

2.3不同日齡大鼠ABR反應(yīng)閾比較 生后14、16、18、22、26、30及35天大鼠的ABR閾值見表2。1、2和4 kHz頻率的ABR閾值第26天與35天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；16和 32 kHz的ABR閾值第22天與35天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；8 和48 kHz的ABR閾值第18天與35天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所以到生后第26天，大鼠各頻率聽敏度已達(dá)到正常水平。

3 討論

Friedman[3]運(yùn)用gap-PPI測試手段研究大鼠的時(shí)間分辨率與年齡以及經(jīng)驗(yàn)的相關(guān)性。他們選用生后15天、35天及64天的大鼠，每只大鼠均進(jìn)行連續(xù)5天的測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨年齡增加，間隔探測閾值下降，生后15天和35天大鼠的間隔閾值在10～20 ms之間，而生后64天大鼠則為5～10 ms。經(jīng)過連續(xù)5天的測試，所有年齡組大鼠的間隔閾值均比第一天下降，這一現(xiàn)象提示在發(fā)育早期和成熟期，感覺處理中存在依賴經(jīng)驗(yàn)的可塑性機(jī)制。然而，生后15天大鼠的聽覺系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，且生后10天至20天是大鼠聽覺發(fā)育最快的時(shí)期，因此連續(xù)5天測試后間隔閾值的降低不僅僅有經(jīng)驗(yàn)依賴性的影響，快速發(fā)育完善的聽功能也起了重要的作用，F(xiàn)riedman的實(shí)驗(yàn)無法區(qū)分聽覺系統(tǒng)發(fā)育、經(jīng)驗(yàn)及其相互作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種背景噪聲下，都可觀察到隨日齡增加，間隔閾值降低，時(shí)間分辨率提高。證實(shí)了攜帶gap的背景噪聲的頻譜越寬，間隔閾值越低，在背景噪聲為8～32 kHz時(shí)獲得的間隔閾值普遍比1～48 kHz時(shí)要高，其原因在于通過整合多頻率上的信息獲得了更佳的時(shí)間分辨率。在背景噪聲為1～48 kHz時(shí)，無法排除日益發(fā)育、增加的可聽頻率范圍間隔探測的影響。有文獻(xiàn)[4]表明2～4 kHz背景噪聲下，間隔閾值大于29 ms； 4～8 kHz噪聲下的間隔閾值為16 ms；8～16 kHz噪聲下的閾值為7 ms，16～32 kHz和32～64 kHz背景噪聲下的間隔閾值是2 ms。因此，1～48 kHz背景噪聲下所測得的間隔閾值，不能精確反應(yīng)時(shí)間分辨率的發(fā)育和聽敏度發(fā)育的關(guān)系。本研究結(jié)果還顯示兩種背景噪聲下的大鼠的時(shí)間分辨率均在第30天發(fā)育成熟，與第35天大鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這種結(jié)果的差異性有待進(jìn)一步研究。

發(fā)育中大鼠ABR的變化直接反映了大鼠內(nèi)耳和聽覺傳導(dǎo)通路的成熟過程，大鼠是較理想的聽覺系統(tǒng)生后發(fā)育研究對象[5，6]，生后第14天的大鼠90 dB SPL短純音可引出ABR，隨著日齡增加，其ABR閾值明顯下降，頻率范圍由窄變寬，至生后第35天ABR閾值已與成年大鼠無異。本研究結(jié)果顯示，在生后第14天，中頻區(qū)可以記錄到穩(wěn)定的腦干電位，然而，此時(shí)大鼠的聽覺頻率范圍較窄，為4～32 kHz左右；生后第16天，4～32 kHz頻率范圍內(nèi)的ABR閾值穩(wěn)定下降，并且向48 kHz和1、2 kHz發(fā)展，但是聽覺敏感度還很低；到生后第18天高頻區(qū)ABR反應(yīng)閾明顯下降，到生后第22～26天各頻率ABR反應(yīng)閾值均明顯下降，已與成年大鼠閾值無明顯差異。對于低、中、高頻聽覺發(fā)育的先后順序尚存爭議[7,8]，Ehret[9]認(rèn)為大鼠聽覺最敏感的頻率最先發(fā)育，即10～20 kHz。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ehret一致，大鼠最先發(fā)育的頻率在15 kHz左右。

從本研究結(jié)果看，大鼠聽敏度在26天左右已經(jīng)與成年鼠無異，而時(shí)間分辨率要到第30天才發(fā)育成熟。時(shí)間分辨率發(fā)育落后于聽敏度的成熟可能的原因如下：首先可能是初級(jí)聽覺通路中的時(shí)間編碼，如時(shí)相同步(phase locking)發(fā)育較慢。時(shí)間編碼通常在外周聽覺系統(tǒng)發(fā)育完全后一段時(shí)間內(nèi)才成熟，而且可能與其他中樞核團(tuán)的成熟有關(guān)。其次，在外周聽覺系統(tǒng)有功能后，聽覺頻率分辨率和強(qiáng)度分辨率迅速增加，很快達(dá)到成年水平。因此，由于時(shí)間編碼發(fā)育速度相對落后，時(shí)間分辨率的發(fā)育成熟落后于聽敏度。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)聽皮層(auditory cortes,AC)神經(jīng)元的調(diào)諧特性和時(shí)間分辨率有很強(qiáng)的相關(guān)性[10]。在發(fā)育過程中，AC神經(jīng)元的調(diào)諧曲線變得更為尖銳，同樣，時(shí)間分辨率發(fā)育迅速成熟。本實(shí)驗(yàn)表明從14天到35天，大鼠的間隔閾值由50 ms降低到8 ms，這一時(shí)間段和AC的發(fā)育時(shí)間相一致[2]。AC在間隔測試中的作用也十分重要，破壞AC可減弱間隔探測能力[11]，但當(dāng)AC功能性退化后，大鼠雖然失去對gap的探測能力，但是仍可探測短音[12]。同時(shí)，聽覺時(shí)域處理能力不僅依靠聽功能，更有神經(jīng)元的整合過程。研究發(fā)現(xiàn)聽皮層與時(shí)間分辨率的發(fā)育有關(guān)，另外還有其他的聽覺中樞核團(tuán)，例如膝狀體、上橄欖復(fù)合體、丘腦和腦干[11, 13]的參與，這些聽覺中樞尚未完全發(fā)育成熟時(shí)，對外界信號(hào)的傳入及調(diào)控能力不高，也影響時(shí)間分辨率。

本試驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠聽覺系統(tǒng)發(fā)育過程中，最先發(fā)育的頻段是中頻區(qū)，隨后向低頻和高頻擴(kuò)展，聽敏度在大約26天左右發(fā)育成熟；伴隨著其聽覺頻率的不斷擴(kuò)展，聽閾的降低，時(shí)間分辨率也逐漸成熟，大約在30天左右完成發(fā)育。

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