神經營養(yǎng)因子對耳蝸螺旋神經元的作用

劉濤 綜述 竇艷玲 審校

感音神經性聽力損失主要源自耳蝸毛細胞和/或螺旋神經元的損傷和退化，耳蝸螺旋神經元(spiral ganglion neuron，SGN)是傳導聽覺信息的一級神經元，噪聲、感染、耳毒性藥物和衰老等諸多因素直接或者間接使螺旋神經元受損，可導致感音神經性聽力損失，而哺乳動物螺旋神經元的再生能力非常低，因此保護螺旋神經元或者修復受損的螺旋神經元對恢復聽力有關鍵性的作用。神經營養(yǎng)因子是神經細胞存活的依賴因子，是成熟神經元功能的調控因子，也是神經元受損和病變損傷時保護和促進其再生的必需因子。近年來，為了更好地提高人工耳蝸的效能、對神經營養(yǎng)因子在螺旋神經元生長和損傷修復過程中的作用研究不斷進展，神經營養(yǎng)因子在螺旋神經元發(fā)育、損傷修復、防止退化及維持其正常生理功能中的重要作用逐漸被揭示[1～3]。

與聽覺系統(tǒng)發(fā)育密切相關的神經營養(yǎng)因子有神經營養(yǎng)因子-3(neurotrophin-3, NT-3)、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、膠質細胞神經營養(yǎng)因子(glial cell line- derived neurotrophic factor, GDNF)、白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor, LIF)等[4]。目前大多學者認為，毛細胞可以合成和分泌多種營養(yǎng)因子支持和保護螺旋神經元，且神經營養(yǎng)因子在耳蝸內保持較高表達水平是發(fā)揮其活性作用的關鍵，毛細胞受損后，螺旋神經元失去神經營養(yǎng)因子的保護作用發(fā)生退行性變。Lefebvre等(1994)體外研究表明，BDNF、NT-3、NT-4/5、GDNF、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、纖毛神經營養(yǎng)因子(ciliary neuroteophic factor, CNTF)等都能促進體外培養(yǎng)的新生大鼠SGN的存活[5]。在螺旋神經元原代培養(yǎng)過程中適時適量地加入神經營養(yǎng)因子已是提高螺旋神經元的純度和活性的重要手段之一。

1 神經營養(yǎng)因子對螺旋神經元的作用

在體實驗證明了直接在耳蝸內注入神經營養(yǎng)因子特別是BDNF能提高耳聾后螺旋神經元的存活率[6]。BDNF作為神經營養(yǎng)因子中的一員，在神經系統(tǒng)發(fā)育、正常生理功能維持和神經受損修復過程中都發(fā)揮著重要作用，不僅調節(jié)著聽覺神經元的成熟、增殖、分化，而且對前庭神經元和部分聽覺神經元的存活有促進作用[4]。BDNF可能通過維持細胞內鈣離子濃度、減少自由基損傷、抑制細胞凋亡和(或)促進細胞功能恢復穩(wěn)定而起到保護作用。研究表明在螺旋神經元上有BDNF高親和性受體，在螺旋神經元神經突起發(fā)育的過程中，BDNF在毛細胞內高濃度表達，將BDNF注入耳蝸內可阻止失去毛細胞支持后螺旋神經元的變性退變[7]。Xie等[8，9]研究發(fā)現BDNF基因工程細胞具有很強的生物學活性，能夠促進螺旋神經元的生長，在螺旋神經元氧化損傷時具有明顯的保護作用。BDNF能減少聽覺神經元的損失，而且促進軸突的再生，因而可能提高人工耳蝸植入的效果[10]。在體外螺旋神經元培養(yǎng)過程中，BDNF能刺激單離培養(yǎng)的未成熟神經元軸突的生長[10]。翟所強等[11]對噪聲損傷模型小鼠給予外源性的BDNF后，其較對照組螺旋神經元的存活量有顯著改變，證明BDNF能保護螺旋神經元。Darius等[12]研究發(fā)現BDNF體外基因治療對螺旋神經元的保護作用耳蝸底回較蝸頂更明顯。Martijn等[13]的研究發(fā)現BDNF提高螺旋神經元存活率的作用可持續(xù)到停止治療后2周，在BDNF治療后，治療組動物的閾上電誘發(fā)聽性腦干反應幅值顯著大于耳聾動物，與正常聽覺動物差異無統(tǒng)計學意義，在停止給予BDNF后，治療組的閾上電誘發(fā)聽性腦干反應幅值也不會顯著降低。應用神經營養(yǎng)因子處理后的螺旋神經元保存了電應激性，給予神經營養(yǎng)因子動物的電誘發(fā)聽性腦干反應潛伏期較對照組(灌入人工外淋巴液的耳聾動物)明顯縮短[14～16]，這些均提示神經營養(yǎng)因子的作用可持續(xù)。在人工耳蝸的實驗中，通過滲透泵給發(fā)育中動物的耳蝸內注入BDNF，可觀察到在植入電極上有包繞髓鞘的神經軸突向鼓階萌芽[17]。

NT-3是一種多功能的神經營養(yǎng)因子，對神經系統(tǒng)發(fā)育及維持其正常生理功能有重要意義，是迄今發(fā)現的維持螺旋神經元存活的作用最顯著的神經營養(yǎng)因子之一[18]。NT-3是Ⅰ型螺旋神經元的主要生長因子，可作為小鼠螺旋神經元離體細胞培養(yǎng)的生存因子。Zhou等[19]研究發(fā)現NT-3對常規(guī)神經元有維持存活作用，對缺氧神經元有明顯保護作用，能夠促進神經元軸突生長，降低缺氧造成的損傷，促進神經元的存活，其機制可能是通過上調c-jun基因的表達而促進神經元的生長，提高其活力。耳蝸毛細胞能分泌NT-3，當毛細胞損傷后，NT-3分泌減少，可繼發(fā)引起神經纖維和螺旋神經元的變性死亡，而當耳毒性藥物、興奮性刺激等損傷后，給予大量外源性NT-3可明顯減少螺旋神經元的變性死亡[20]。Bibel等[21]研究發(fā)現在先天性缺乏BDNF和NT-3或其受體的小鼠中，感覺神經元嚴重缺失，NT-3基因敲除小鼠的螺旋神經元嚴重缺失，細胞數量明顯低于正常水平，由于無NT-3表達，Ⅰ型螺旋神經元缺失。Chen等[22]證實在體外培養(yǎng)中，NT-3的濃度與螺旋神經元的生物活性正相關。研究證明，利用單純皰疹病毒介導產生神經營養(yǎng)因子-3能減弱順鉑對成年老鼠外周聽覺系統(tǒng)的毒性，證明在活體內通過神經營養(yǎng)因子-3基因治療，有希望預防化學藥物導致的聽力損失，并可能預防老年聽覺退化[23]。

GDNF是迄今發(fā)現的活性最強的神經元神經營養(yǎng)因子之一，是轉化生長因子-β(TGF-β)超家族的一員，體內很多細胞可以合成GDNF，影響神經元的發(fā)育和存活，它可通過磷酸肌醇3激酶(PI3-K)、G蛋白、cAMP和MAP激酶等途徑介導GDNF信號轉導，維持未成熟神經元的生存、分化和增殖，支持成熟神經元的生存適應，介導神經元的可塑性，能抑制凋亡而延長受損和退變的神經元的生存時間，修復其功能。有研究表明，GDNF在新生大鼠內耳的內外毛細胞中表達，在成熟大鼠內毛細胞中也有表達，GDNF的受體GFRα-1、酪氨酸激酶受體Ret在螺旋神經元上也有表達[24]。Ylikoski等[25]向豚鼠鼓階內緩慢注入GDNF后，觀察強噪聲下GDNF對聽神經的保護作用，結果發(fā)現GDNF可以明顯提高噪聲損傷后螺旋神經元的存活率。噪聲暴露后，耳蝸內GDNF的mRNA表達水平明顯加強[26]，GDNF對噪聲、耳毒性藥物等引起的聽力損失具有明顯保護作用。Yagi等[27]利用腺病毒載體進行基因治療證明應用GDNF或其他因子進行基因治療后，內耳毛細胞損失后螺旋神經元的存活率顯著提高。Stover等[28]通過RT-PCR及Western blot免疫化學的方法在螺旋神經元內觀察到了GDNF、GFRal、Ret三種蛋白的分布。朱雅穎等[29]研究表明耳蝸內長期灌注GDNF對耳毒性藥物損傷后殘余的螺旋神經元有保護作用，可避免細胞進一步丟失，對損傷的細胞可能有修復作用。

2 神經營養(yǎng)因子之間的相互影響

在活體外實驗中，BNDF和CNTF協(xié)同作用較各自作用能更有效提高螺旋神經元的存活率[30]。聯(lián)合應用BDNF和成纖維生長因子-1能更有效提高螺旋神經元存活和促進神經元周圍突的生長。

研究發(fā)現神經營養(yǎng)因子BDNF和NT-3在活體和離體培養(yǎng)中都是維持聽覺上皮和聽覺神經元生存的重要物質。內耳毛細胞釋放神經營養(yǎng)因子-3和腦源性神經生長因子對螺旋神經元存活是基本必須的[31]，并且BDNF和NT-3對螺旋神經元的存活、生長和功能有調節(jié)作用，并相互協(xié)調相互影響[32，33]。BDNF和NT-3可通過結合其高親和力受體影響螺旋神經元生長和發(fā)育過程，均能促進神經元的存活，其中BDNF效果更明顯。近年來發(fā)現BDNF在螺旋神經元生長和發(fā)育過程中主要促進胞體發(fā)育，而NT-3主要促進軸突分化和生長，并且發(fā)現BDNF、NT-3均能刺激分離培養(yǎng)的未成熟螺旋神經元的軸突生長，但對成熟的螺旋神經元，無論是BDNF還是NT-3均不能促進軸突生長，可能在發(fā)育成熟的神經系統(tǒng)中，神經營養(yǎng)因子的作用發(fā)生了改變。

在GDNF對內耳保護作用的研究中發(fā)現NT3對GDNF的增強作用具有特異性[36]，聯(lián)合應用GDNF和NT-3能夠顯著提高SGN體外培養(yǎng)的存活率，NT-3能增強GDNF誘導的Ret酪氨酸磷酸化，因而使螺旋神經元發(fā)育存活所需的Akt磷酸化反應大大增強。有研究表明在耳毒性藥物制造的耳聾動物模型中，應用NT-3和GDNF在耳蝸共同轉導，不僅能夠增強神經營養(yǎng)因子對耳蝸的保護，而且能降低耳毒性藥物對聽力的損傷[34]。GDNF和NT-3的聯(lián)合作用是協(xié)同效應，可顯著提高螺旋神經元的存活率[35]。

CNTF和LIF也具有促進螺旋神經元的軸突生長的作用，而同時應用LIF與BDNF時，兩者具有協(xié)同作用，可促進神經元軸突的生長[37]。在螺旋神經元培養(yǎng)過程中，LIF與NT-3因子也相互影響其作用的發(fā)揮，LIF能間接增強NT-3的誘導效應，促進神經元的存活[11]。

3 展望

進行性的SGN變性部分原因是因為失去毛細胞支持后缺少神經營養(yǎng)因子，因此，神經營養(yǎng)因子被認為可以阻止和延緩SGN的變性。噪聲損傷后，內耳內BDNF、GDNF、NT-3等神經因子mRNA表達均有增強，內耳毛細胞及螺旋神經元損傷時，各種神經營養(yǎng)因子可能協(xié)同作用，而非一種因子的作用。近年來，對神經營養(yǎng)因子在內耳的研究已廣泛開展，但仍然處于初步階段，對內耳興奮性刺激、耳毒性藥物、缺血性損傷后螺旋神經元的保護和損傷的研究尚有待進一步發(fā)展。利用耳蝸內持續(xù)灌注、通過病毒載體的基因治療等方法，均在動物實驗中證明了神經營養(yǎng)因子能保護感音神經性聾殘余神經細胞，可避免更多的細胞丟失，也能提高靶神經元的存活。螺旋神經元的存活數量和生物活性尤為重要，利用神經營養(yǎng)因子的治療，很可能使人工耳蝸植入更有效發(fā)揮作用[9]。研究神經營養(yǎng)因子對螺旋神經元的保護與細胞修復、分子機制以及將來可行的治療方法將為治療感音神經性聾開辟新途徑。

4 參考文獻

1 Kanzaki S, Stover T, Kawamoto K, et al. GDNF and chronic electrical stimulation prevent VIII cranial nerve degeneration following denervation[J]. Comp Neurol, 2002,454:450.

2 Shepherd RK, Coco A, Epp SB, et al. Chronic depolarization enhances the trophic effects of brain-derived neurotrophic factor in rescuing auditory neurons following a sensorineural hearing loss[J]. Comp Neurol,2005, 486:145.

3 Pettingill LN, Richardson RT, Wise AK, et al. Neurotrophic factors and neural prostheses: Potential clinical applications based upon findings in the auditory system[J]. IEEE Trans Biomed Eng，2007, 54:1 138.

4 Carroll P, Lewin GR, Koltzenburg M, et al. A role for BDNF in mechanosensation[J]. Nat Neurosci, 1998, 1: 42.

5 Lefebvre PP,Malgrange B,Staecer H,et al.Neurotrophins affect survival and neuritogenesis by adult injured auditory neurons in vitro[J].Neuroreport,1994,5:865.

6 Gillespie LN, Clark GM, Bartlett PF, et al. BDNF-induced survival of auditory neurons in vivo: Cessation of treatment leads to accelerated loss of survival effects[J]. Neurosci Res,2003,71:785.

7 Nakaizumi T, Kawamoto K, Minoda R, et al. Adenovirus-mediated expression of brain-derived neurotrophic factor protects spiral ganglion neurons from ototoxic damage[J]. Audiol Neurootol,2004, 9:135.

8 Xie D, Liu G, Zhu G, et al. Epigallocatechin-3-gallate protects culture spiral ganglion cells from H2O2 induced oxidizing damage.[J] Acta Otolarynal, 2004, 124:464.

9 劉國輝, 謝鼎華, 朱綱華,等. EGCG對氧化氫造成的螺旋神經節(jié)細胞損害的抑制作用[J]. 聽力學與言語疾病雜志,2004, 12: 317.

10 Miller JM, Le Prell CG, Prieskorn DM，et al. Delayed neurotrophin treatment following deafness rescues spiral ganglion cells from death and promotes regrowth of auditory nerve peripheral processes: Effects of brain-derived neurotrophic factor and fibroblast growth factor[J]. Neuroscience Research,2007, 85:1 959.

11 翟所強, 郭維, 胡吟燕. 腦源性神經營養(yǎng)因子對螺旋神經節(jié)的保護作用[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志,2002, 37: 109.

12 Darius R, Lee VA, Abrashkin KA, et al. Cochlear implants and ex vivo BDNF gene therapy protect spiral ganglion neurons[J]. Hearing Research,2007, 228:180.

13 Martijn JH, Sjaak FL, Klis，et al. Enhanced survival of spiral ganglion cells after cessation of treatment with brain-derived neurotrophic factor in deafened guinea Pigs[j]. Assoc Res Otolaryngol,2009, 10:355.

14 Yamagata T, Miller JM, Ulfendahl M, et al. Delayed neurotrophic treatment preserves nerve survival and electrophysiological responsiveness in neomycin-deafened guinea pigs[J]. Neurosci Res,2004, 78:75.

15 Maruyama J, Miller JM, Ulfendahl M. Glial cell line-derived neurotrophic factor and antioxidants preserve the electrical responsiveness of the spiral ganglion neurons after experimentally induced deafness[J]. Neurobiol,2008, 29:14.

16 Shepherd RK, Coco A, Epp SB, et al. Chronic depolarization enhances the trophic effects of brain-derived neurotrophic factor in rescuing auditory neurons following a sensorineural hearing loss[J]. Comp Neurol,2005, 486:145.

17 Leake PA,Stakhovskaya O,Hradek GT, et al. Factors influencing neurotrophic effects of electrical stimulation in the deafened developing auditory system[J]. Hear Res,2008, 242:86.

18 Staecker H,Galinovic-Schwartz V,Liu W,et al.The role of the neurotrophins in maturation and maintenance of postnatal auditory innervation[J].Am J Otol,1996,17:486.

19 Zhou ZP,Liu Q,Davis RL. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3 [J]. The Joumal of Neuroscience, 2005, 25:7 558.

20 Bower WJ,Chen X,Huang G,et al.Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea[J].Mol Ther,2002,6:12.

21 Bibel M, Barde YA. Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous system [J]. Neurosci, 2000, 14: 2 919.

22 Chen X, Frisina RD, Bower WJ, et al. HSV amplicon-mediated neurotrophins-3 expression protects murine spiral ganglion neurons from cisplatin- induced damage[J]. Mol Ther, 2001, 3: 958.

23 Bowers WJ, Chen X, Guo H, et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea[J]. Mol Ther,2002, 6:12.

24 Stove T, Nam YJ, Gong TWL, et al. Glial cell line- derived neurotrophic factor (GDNF) and its receptor complex are expressed in the auditory nerve of the mature rat cochlea[J]. Hear Res, 2001, 155: 143.

25 Ylikoski J, Pirvola U, Virkkala J, et al. Guinea pig auditory neurons are protected by glial cell line-derived growth factor from degeneration after noise trauma[J]. Hear Res,1998,124:17.

26 Nam YJ, Stover T, Hartman SS, et al. Upregulation of glial cell line-derived neurotrophic factor( GDNF) in the rat cochlea following noise[J]. Hear Res, 2000, 146: 1.

27 Yagi M,Kanzaki S, Kauamoto K,et al. Spiral ganglion neurons are protected from degeneration by GDNF gene therapy[J]. Journal of the Association for Research in Otolaryngoloy, 2000, 1: 315.

28 Stover T, Nam Y, Gong TL, et al. Glial cell line- derived neurotrophic factor(GDNF) and its receptor complex are expressed in the auditory nerve of the mature rat cochlea [J]. Hear Res,2001, 155: 143.

29 朱雅穎, 戴春富, 余洪猛,等. 膠質細胞來源的神經營養(yǎng)因子對螺旋神經節(jié)神經元耳毒性損傷的保護作用[J]. 聽力學及言語疾病雜志, 2006, 14: 48.

30 Shinohara T,Bredberg G,Ulfendahl M, et al. Neurotrophic factor intervention restores auditory function in deafened animals[J]. The National Academy of Sciences,2002,99:1 657.

31 Ani K, Jay J, Caley M, et al. In Vitro and In Vivo Assessment of the Ability of Adeno-Associated Virus Brain-Derived Neurotrophic Factor to Enhance Spiral Ganglion Cell Survival Following Ototoxic Insult [J]. Laryngoscope, 2002, 112:1 325.

32 Evans AJ, Thompson BC, Wallace GG,et al. Promoting neurite outgrowth from spiral ganglion neuron explants using polypyrrole/BDNF-coated electrodes[J]. Journal of Biomedical Materials Research,2009,91:241.

33 Flores-Otero J, Xue HZ, Davis RL, et al. Reciprocal regulation of presynaptic and postsynaptic proteins in bipolar spiral ganglion neurons by neurotrophins[J]. Neuroscience,2007, 27:14 023.

34 Suzuki M, Yagi M, Brown JN, et al. Effect of transgenic GDNF expression on gentamicin-induced cochlear and vestibular toxicity[J]. Gene Ther, 2000, 7:1 046.

35 陳曉巍，李紅，曹克利，等.神經營養(yǎng)因子共轉導對小鼠耳蝸螺旋神經節(jié)細胞的保護用用[J].中華醫(yī)學雜志，2003，83：1 517.

36 Treanor JJ,Goodman L,Stone DM,et al.Characterization of a multicomponent receptor for GDNF[J].Nature,1996,382:80.

37 Gillespie LN, Clark GM, Bartlett PF, et al. LIF is more potent than BDNF in promoting neurite outgrowth of mammalian auditory neurins in vitro [J]. Neuroreport, 2001, 12: 275.