Survivin、COX-2與膽管癌的血管生成

歐陽波，張有成，黃 強

近年來的大量研究表明，Survivin和COX-2在多種腫瘤組織中過表達，通過抑制腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤血管生成等機制參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但Survivin和COX-2是否通過影響腫瘤血管形成來影響膽管癌的生物學行為尚未清楚。為此我們采用免疫組織化學技術檢測Survivin、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和CD34在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達，并探討他們與臨床病理特征的關系及Survivin、COX-2表達與VEGF表達及微血管密度(microvessel density，MVD)的相關性，為膽管癌的抗血管治療提供一個新的途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本采集 選取安徽省立醫(yī)院2005年3月—2008年2月手術切除膽管癌標本32例，其中男17例，女15例，年齡43～79歲，平均年齡60.3歲，術前均未行放化療等抗腫瘤治療，所有標本均經(jīng)病理證實，另選正常膽管組織9例為對照組。所有標本均用10%甲醛固定，石蠟包埋，每個蠟塊行4 mm厚連續(xù)切片。

1.2 主要試劑 鼠抗人Survivin單克隆抗體，鼠抗人COX-2單克隆抗體，鼠抗人VEGF單克隆抗體，鼠抗人CD34單克隆抗體，PV6000試劑盒、濃縮型二甲基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒均為北京中杉生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法 用免疫組織化學SP二步法。將已知陽性的結腸癌切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)代替一抗作為陰性對照。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定 (1) CD34陽性判斷及MVD計數(shù)：采用Weidner法，抗CD34單抗表達于血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)或胞膜，任何染色成棕黃色的單個細胞或細胞團，不管其是否形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤組織和其他連接組織有清楚的分離，都認為是一個可記數(shù)的微血管。每一標本先于低倍鏡(×100)下選3個微血管數(shù)最多的區(qū)域，然后在高倍鏡(×400)下記數(shù)每一個區(qū)域中5個血管最高密度區(qū)的微血管數(shù)，取均值代表MVD值。(2) VEGF、COX-2與Survivin的結果判斷：VEGF陽性表達為每張切片中看到有大于5%的腫瘤細胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒；COX-2陽性表達為每張切片中看到有大于5%的腫瘤細胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒；Survivin陽性表達為每張切片中看到有大于5%的腫瘤細胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

2 結果

2.1 膽管癌組和正常膽管組中MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達 具體見表1。

表1 膽管癌組與對照組MVD、VEGF和Survivin表達比較

注：與對照組相比，at=13.36，P<0.01；bχ2=6.35，P<0.05；cχ2=11.96，P<0.05；dχ2=14.88，P<0.01

在膽管癌組織中檢測到VEGF(圖1)、COX-2(圖2)、CD34(圖3)和Survivin(圖4)的表達；而在正常膽管組中無Survivin表達，只有1例COX-2微弱表達，MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達在兩組中差異有顯著性意義。

圖1 膽管癌中VEGF陽性表達 (SP染色，×400)

圖2 膽管癌中COX-2陽性表達 (SP染色，×400)

圖3 膽管癌中CD34陽性表達(SP染色，×400)

圖4 膽管癌中Survivin陽性表達(SP染色，×400)

2.2 膽管癌組織MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達與臨床病理資料的關系 膽管癌組織MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的大小、分化無關；而有轉(zhuǎn)移者則較無轉(zhuǎn)移者均顯著增高。見表2。

2.3 膽管癌組織MVD與VEGF的表達的相關性 在32例膽管癌病例中，VEGF陽性表達的有21例，其平均MVD為62.97，VEGF表達陰性的平均MVD為34.06，兩組比較t=9.35P<0.01，說明VEGF的表達與MVD相關。

2.4 Survivin、COX-2與MVD、VEGF表達的相關性 Survivin陽性表達的病例有23例，其中20例VEGF表達陽性(87.0%)，在Survivin表達陰性的9例中，只有1例VEGF表達陽性(11.1%)，兩組比較χ2=13.31，P<0.01，表明VEGF表達與Survivin表達密切相關；在23例Survivin陽性表達的膽管癌中，MVD平均數(shù)為60.94，明顯高于Survivin陰性表達的9例(MVD平均數(shù)為32.82)，兩組比較t=8.31，P<0.01；Survivin與VEGF共陽性表達的有20例，其MVD平均數(shù)為63.86，明顯高于共陰性表達的8例(MVD平均數(shù)為31.28)，兩組比較t=11.13，P<0.01。COX-2陽性表達的病例有25例，其中20例VEGF表達陽性，在COX-2表達陰性的7例中，只有1例VEGF表達陽性，兩組比較χ2=7.76，P<0.01，表明VEGF表達與COX-2表達密切相關；在25例COX-2陽性表達的病例中，其MVD平均數(shù)為58.95，明顯高于COX-2陰性表達的7例(MVD平均數(shù)為31.89)，兩組比較t=6.89 ，P<0.01；COX-2與VEGF共陽性表達病例有20例，其MVD平均數(shù)為63.78，明顯高于共陰性表達的6例(MVD平均數(shù)為29.42)，兩組比較t=11.96,P<0.05。

表2 MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達與膽管癌臨床病理特征的關系

注：與對照組相比，at=6.55，P<0.01；bχ2=16.67，P<0.05；cχ2=4.17，P<0.05；dχ2=2.99，P>0.05

3 討論

1971年，F(xiàn)olkman首先提出腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有血管依賴性。大量研究證實腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，阻斷血管生成是抑制腫瘤生長的有效策略，由此產(chǎn)生了抗血管生成治療腫瘤的設想。隨著人們對腫瘤血管生成機制更為廣泛深入的研究，針對腫瘤血管生成分子機制所設計的抗血管生成策略，成為腫瘤治療研究的新熱點。膽管癌是膽道常見的惡性腫瘤，既往認為膽管癌是一種血管分布相對較少的腫瘤，但隨著對膽管癌形成分子機制研究的深入，血管生成在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的重要性已逐步受到重視。

VEGF是迄今鑒定出來的最重要的血管生成因子，與腫瘤血管新生密切相關，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預后有關[1]。MVD不僅與腫瘤細胞的營養(yǎng)和供氧有關，還是一個有意義的預測性指標[2]。本實驗顯示在膽管癌組中的VEGF表達和MVD平均值顯著高于正常膽管組織，提示血管新生在膽管癌的發(fā)展過程中同樣起重要作用，且VEGF、MVD與膽管癌轉(zhuǎn)移關系密切，由此推測VEGF、MVD可能與膽管癌的轉(zhuǎn)移和預后相關。

Survivin是一種結構獨特的凋亡蛋白抑制因子家族的成員，特異地表達于人和鼠的胚胎發(fā)育組織以及多數(shù)人類腫瘤細胞。研究表明，Survivin在細胞凋亡和細胞周期的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，使其成為一個非常有吸引力的癌癥治療靶點；我們前期的研究發(fā)現(xiàn)Survivin基因參與了膽管癌細胞增殖和凋亡過程[3]，本實驗結果顯示在膽管癌中Survivin基因的表達與轉(zhuǎn)移相關，但與患者的性別、年齡及腫瘤的大小、分化等無關。

血管形成過程的核心是內(nèi)皮細胞的分裂增殖，確切地說，取決于血管內(nèi)皮細胞的生存和凋亡平衡的結果，有研究證實在腫瘤血管生成過程中內(nèi)皮細胞中表達的VEGF可誘導和促進Survivin的高表達，而高表達的Survivin抑制了各種指向caspases的凋亡機制，從而保護內(nèi)皮細胞逃避凋亡[4]。相反，Survivin表達缺乏可導致內(nèi)皮細胞及新生毛細血管的退化。研究顯示向內(nèi)皮細胞中導入靶向Survivin的反義寡核苷酸，結果VEGF的促內(nèi)皮細胞功能受到抑制，從而促進腫瘤內(nèi)皮細胞凋亡，抑制腫瘤血管的新生，最后導致腫瘤生長受到抑制，達到治療腫瘤的目的[4-5]。可見，VEGF促進了Survivin的表達，而同時高表達的Survivin又維持和保護了VEGF的促內(nèi)皮細胞功能，從而促進了腫瘤血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移。由此推測：VEGF的表達上調(diào)可能直接或間接地參與Survivin的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成的調(diào)控，及其蛋白功能活化的過程，從而增加Survivin的積累；而Survivin的過度表達，使G2/M期點失控，細胞失去了正常增殖周期中凋亡開關的限制，可促使腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖凋亡平衡失調(diào)，還可能作為腫瘤血管生成的調(diào)控因子參與腫瘤血管生成。本實驗結果顯示Survivin與VEGF、MVD在膽管癌中的表達具有正相關性，Survivin與VEGF共陽性表達比共陰性表達癌組織中的MVD顯著增高，說明Survivin與VEGF、MVD之間的關系密切及Survivin與VEGF在促血管形成方面有協(xié)同作用。

環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2) 是前列腺素生物合成的限速酶，大量研究表明COX-2表達增強與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，COX-2上調(diào)可能是腫瘤發(fā)生過程中一個重要的限速步驟，COX-2可能通過促進腫瘤細胞增殖和抑制細胞凋亡、促進腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、促進腫瘤血管生成等機制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。COX-2不僅在多種腫瘤中過表達，而且在原發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤的新生血管內(nèi)皮細胞中高表達。敲除COX-2基因的實驗動物腫瘤組織血管密度下降，腫瘤生長明顯減慢，提示COX-2與腫瘤血管生成關系密切。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2可誘導VEGF和bFGF等促血管生成因子表達，并可通過基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和Integrins促腫瘤血管生成。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)COX-2基因參與了膽管癌細胞增殖和凋亡過程[7]。本實驗結果顯示，COX-2在膽管癌中高度表達，而在正常膽管組中只有1例微弱表達，提示COX-2可能對膽管癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用，但COX-2的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的大小、分化及是否轉(zhuǎn)移無關；實驗結果還顯示COX-2與VEGF、MVD在膽管癌中的表達具有正相關性，COX-2與VEGF共呈陽性表達比共呈陰性表達癌組織中的MVD顯著增高(P<0.01)，我們認為COX-2表達和膽管癌血管生成有關，而VEGF可能是COX-2誘導膽管癌血管生成的重要介質(zhì)，COX-2與VEGF、MVD之間的密切關系及COX-2與VEGF在促血管生成方面有協(xié)同作用。

鑒于血管生成在腫瘤發(fā)生發(fā)展及血行轉(zhuǎn)移中的特殊作用，COX-2、Survivin和VEGF可能通過影響腫瘤血管生成在膽管癌轉(zhuǎn)移等惡性行為中發(fā)揮著重要作用。但是，膽管癌的發(fā)生是一個極其復雜的過程，是多基因協(xié)同作用、多因素共同參與、綜合發(fā)展的結果，COX-2、Survivin不僅可以參與膽管癌細胞的增殖和凋亡過程，而且可促進血管的生成，但其過表達只是其中的一種形式，深入研究COX-2、Survivin及其在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，有可能從另一方面揭示膽管癌的發(fā)病機制，使得靶向COX-2、Survivin的抗腫瘤治療具有廣泛的應用前景，并為膽管癌的臨床診治開辟一條新的途徑，延緩膽管癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高膽管癌的療效。

[1]Martins SF,Reis RM,Rodrigues AM,et al.Role of endoglin and VEGF family expression in colorectal cancer prognosis and anti-angiogenic therapies[J].World J Clin Oncol,2011,2(6):272-280.

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[3]歐陽波,黃強,王志華.Survivin、血管內(nèi)皮生長因子及微血管密度在正常膽管組織和膽管癌組織中的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(19):3802-3804.

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[7]歐陽波,黃強,王志華.COX-2在膽管癌中的表達及其與血管生成的關系[J].肝膽外科雜志,2006,14(6):432-435.