保留半肝動脈血供肝血流安全阻斷時限的研究

穆振國，王新偉，王洪遠，梁靜雅，李建新，張 林，曹廣濤

選擇適當肝血流阻斷方式是肝切除手術成功的基礎，保留半肝動脈血供入肝血流阻斷技術適用于半肝阻斷困難的復雜肝切除患者。許多學者臨床實踐證實該技術在減少肝臟缺血再灌注損傷方面優(yōu)于全肝血流阻斷(Pringle法)[1]，但是該方法終究對肝臟有一定的損傷。Pringle法的安全時限為20 min[2]，那么保留半肝動脈血供入肝血流阻斷技術的安全時限究竟是多少，目前尚不確切。本研究通過動物實驗，以Pringle法20 min的動物肝臟損害程度及存活率為評判標準，探討門靜脈自然轉流及非轉流情況下保留半肝動脈血供肝血流阻斷的安全時限，以期指導臨床，尤其對肝硬化合并門靜脈高壓患者實施肝切除時肝門阻斷的再認識有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物為雄性Wistar大鼠，體重230～260 g，由濟寧醫(yī)學院動物實驗中心提供。將大鼠隨機分為 3組：A組為門靜脈轉流下保留半肝動脈血供入肝血流阻斷組，B組為單純保留半肝動脈血供入肝血流阻斷組，C組為全肝入肝血流阻斷組(Pringle法)。每組90只，其中40只觀察存活率(每個時相點10只)，40只供病理學檢查(每個時相點10只)。另取10只做染料示蹤觀察。各組阻斷時相點分別以組別/時間(min)記錄，如A/60代表A組，阻斷60 min，以此類推。

1.2 動物模型的制備

1.2.1 術前準備 實驗動物術前禁食12 h，自由飲水；麻醉方法為腹腔注射苯巴比妥鈉15 mg，切口局部注射0.3%利多卡因0.1 mL。

1.2.2 A組 入腹后切斷所有肝周韌帶，分離出肝左、肝中動脈予以保護，隨后結扎肝右葉肝蒂，用小號動脈夾分別阻斷肝左、肝中葉門靜脈60、90、100、120 min，缺血受累肝臟約占全肝 95%，保留尾狀葉(約占全肝 5 %)血供，作為門靜脈血液經肝臟回流入下腔靜脈的通道。到預定觀察終點，去除肝蒂阻斷夾恢復肝臟灌流，切除肝右葉及尾狀葉(肝切除量約32%)[3]，縫合腹壁切口。

1.2.3 B組 術前準備、麻醉及保留半肝動脈血供方法同A組。肝左、肝中葉門靜脈阻斷時間分別為30、40、60、90 min，不保留尾狀葉血供，完全阻斷門靜脈血流。到預定觀察點，去除肝蒂阻斷夾恢復肝臟灌流，切除肝右葉及尾狀葉，縫合腹壁切口。

1.2.4 C組 即Pringle法，術前準備及麻醉同A、B組。用小號動脈夾阻斷肝十二指腸韌帶，使包括尾狀葉在內的全部肝葉完全缺血，阻斷時間分別為20、30、40、50 min。到預定觀察點，去除肝蒂阻斷夾恢復肝臟灌流，切除肝右葉及尾狀葉，縫合腹壁切口。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 觀察阻斷前后肝臟及胃腸的色質。

1.3.2 用亞甲藍染色示蹤法觀察阻斷血流后門靜脈流出道的完整性及肝臟缺血的完全性。

1.3.3 肝功能檢測 恢復灌注后24 h分別抽血檢測ALT數(shù)值。

1.3.4 肝臟病理組織學檢查 入肝血流阻斷各時相點及恢復灌注后24 h分別取肝組織標本，給以固定、切片、HE染色，光學顯微鏡下組織學觀察。

1.3.5 肝細胞死亡率測定 采用全自動圖象分析系統(tǒng)，在400倍視野下，每張玻片(上述標本)隨機選取10個無血管區(qū)視野，測定檢測區(qū)的蘇木素染色陽性(細胞核染色為主)面積的平均面積百分數(shù)，用以估計相對細胞死亡率。陽性區(qū)的平均面積百分數(shù)越低，表示細胞相對死亡率越高[4]。

1.3.6 恢復灌注后24 h取10 cm空腸以檢查腸黏膜的損害情況。

1.3.7 動物存活率觀察 觀察再灌注后7 d的動物存活率。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 入肝血流阻斷后肝臟及胃腸的色質

2.1.1 A組 肝左、肝中葉由鮮紅色變?yōu)榧t褐色，肝右葉呈紫黑色，尾狀葉顏色不變。恢復灌流后肝左、肝中葉呈紫褐相間的花斑狀，4～5 min后變?yōu)樽仙?，充血，肝緣變鈍、飽滿。阻斷期及恢復血流后的腸壁顏色紅潤，無水腫。

2.1.2 B組 肝左、肝中葉由鮮紅色變?yōu)榧t褐色，肝右葉及尾狀葉均變?yōu)樽虾谏??；謴凸嗔骱蟾巫?、肝中葉呈紫褐相間的花斑狀，4～5 min后變?yōu)樽虾稚?，B/60、B/90肝臟色質恢復緩慢。阻斷期大鼠的腸壁顏色紫黑，水腫明顯，恢復血流4～5 min后腸壁顏色漸漸轉紅潤。

2.1.3 C組 入肝血流阻斷后3～4 min全肝變?yōu)樽虾稚?，隨著阻斷時間的延長漸漸呈暗灰色。腸壁紫黑，全腹腔臟器水腫明顯?；謴凸嗔骱蟾尉壸冣g、肝葉水腫，C/40、C/50肝臟色質恢復緩慢。

2.2 亞甲藍染色示蹤觀察

經門靜脈穿刺注射亞甲藍后，A組可見肝尾葉首先染色，隨后心、肺及胃腸道均有染色，而所阻斷肝葉在復流前不染色。B、C組在經門靜脈穿刺注射亞甲藍后穿刺點滲血，亞甲藍外溢，心、肺、肝均無染色。

2.3 肝臟病理組織學觀察及HE染色(細胞核)陽性面積的平均百分數(shù)

2.3.1 光學顯微鏡下觀察 復流前各組肝臟標本均可見局部肝竇淤血及輕度擴張，肝小葉結構完整，匯管區(qū)正常。復流后A/60、A/90、A/100、B/30、B/40及C/20大鼠肝臟標本可見肝竇明顯充血，肝細胞腫脹，匯管區(qū)炎性細胞浸潤和點片狀壞死灶。A/120、B/60及C/30大鼠肝竇內有淤積的紅細胞和血栓形成，并可見部分細胞空泡變性、胞核消失、胞體崩解。匯管區(qū)有炎性細胞浸潤，肝小葉變形。還可見局灶性肝細胞壞死。B/90、C/40、C/50大鼠24 h內全部死亡，未能獲得標本。

2.3.2 肝臟HE染色(細胞核)陽性面積的平均百分數(shù) A/120、B/60、C/30與C/20對照P<0.05；A/100、B/40與C/20對照P>0.05(見表1)。

2.4 復流后24 h各組ALT數(shù)值

復流后24 h各組ALT數(shù)值與肝門阻斷時間成正相關，阻斷時間越長ALT數(shù)值越高,A/120、B/60、C/30與C/20相比，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05；各組之間因阻斷形式不同差別較大，但差異無統(tǒng)計學意義(A/100、B/40與C/20相比P>0.05)，詳見表1。

表1 各組術后肝功能損害、肝細胞壞死數(shù)及術后存活率分析

注： * 與C/20對照，P>0.05；# 與C/20對照，P<0.05

2.5 小腸組織病理形態(tài)學觀察

A/60、A/90、A100、B/30、B/40、C/20未見明顯的組織學改變；A/120、B/60、C/30可見小腸黏膜絨毛變矮、水腫，上皮下Gruenhagen’s間隙增大，伴隨上皮層與固有層分離，伴隨毛細血管淤血、間質水腫及少量炎性細胞浸潤(以中性粒細胞和淋巴細胞為主)；B/60部分標本出現(xiàn)絨毛破損伴隨固有層毛細血管暴露甚至出血，炎性細胞在固有層或內皮下大量聚集，腸上皮細胞壞死、脫落。

2.6 手術后7d大鼠存活率

A/60、A/90、A/100大鼠無死亡，A/120存活率則下降為40%；B/30、B/40大鼠無死亡，存活率B/60下降至30%，B/90下降為0；C/20大鼠無死亡，C/30存活率下降至70%，C/40、C/50下降為0。各組大鼠死亡時間多發(fā)生在術后1～2天。

3 討論

肝臟是對缺血缺氧甚為敏感的器官,其耐受缺血缺氧的時限可以隨著肝臟所處環(huán)境的變化而變化。復雜肝切除術需要較長時間的肝血流阻斷，當傳統(tǒng)半肝血流阻斷困難的情況下，保留半肝動脈血供肝血流阻斷技術很好地扮演了替代者角色，在減少肝臟缺血再灌注損傷方面優(yōu)于全肝血流阻斷(Pringle法)[5]。然而在臨床實踐中此項技術肝門阻斷多長時間是安全的目前尚不明了，尤其是對肝硬化合并門靜脈高壓患者，當伴有大量門靜脈側枝循環(huán)時，其安全時限是延長還是縮短亦存在許多爭議。

Nakao等[2]通過臨床觀察認為入肝血流阻斷不宜超過 20 min；Tashiro等[6]認為門靜脈阻斷 45 min后,即使再通也會發(fā)生廣泛腸黏膜壞死；趙建勇等[7]進行豬單純門靜脈血流阻斷實驗，發(fā)現(xiàn)阻斷45 min以內的動物存活率為100%，阻斷60 min組則減少到66.7%；丁鈞等[8]發(fā)現(xiàn)利用生物泵行門體靜脈轉流可使家豬常溫下耐受全肝血流阻斷的安全時限從 30 min延長為 90 min。黃波等[9]研究發(fā)現(xiàn)腸腔分流條件下，正常巴馬小型豬耐受單純門靜脈阻斷安全時限為120 min。所以，不難看出，既往所用各種大小動物入肝血流阻斷模型，與保留半肝動脈血供入肝血流阻斷技術均有其不同之處。本實驗設計了門靜脈轉流及非轉流兩種條件下保留半肝動脈血供入肝血流阻斷形式。前者以復流后切除的非缺血肝尾葉作為其他肝葉阻斷期間門靜脈血的流出道，既提升了門靜脈血的壓力，又達到了門靜脈血轉流目的，符合肝硬化合并門靜脈高壓患者的臨床病理機制；兩組實驗動物的肝右葉+肝尾葉切除占全肝總量的32%，其肝切除模型符合臨床手術實際；恢復灌注后24 h取10 cm空腸檢查腸黏膜損害情況可以協(xié)助分析肝臟缺血再灌注損傷以及實驗動物死亡的腸源性因素；以Pringle法阻斷肝門20 min的動物肝臟損害程度為評判標準得出的保留半肝動脈血供肝血流阻斷安全時限(門靜脈轉流或無轉流的情況下)有較高的臨床指導意義。

從本項研究結果可以看出，肝臟的缺血再灌注損傷與肝血流阻斷形式及阻斷時間密切相關，C/20實驗動物手術后7d全部存活，而C/30則存活70%，在術后24 h ALT數(shù)值、HE染色(細胞核)陽性面積的平均百分數(shù)方面，C/20與C/30相比也有顯著差異(P<0.05)。所以，用C/20實驗動物的肝臟損害程度及術后7 d存活率作為安全與否的評判標準是可行的。在A、B、C三組中，A組的阻斷形式對肝臟的損害最輕，B組次之，C組最重。A/100、B/40與C/20損害程度相當，也就是說大鼠門靜脈轉流下保留半肝動脈血供入肝血流阻斷的安全時限是100min，單純保留半肝動脈血供入肝血流阻斷組的安全時限是40 min。

[1]金山,戴朝六,賈昌俊,等.保留半肝動脈血供的入肝血流阻斷法對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響[J].世界華人消化雜志,2007,15(30): 3168-3172 .

[2]Nakao A,Harada A,Nonami T,et al.Regional vascular resection using catheter bypass procedure for pancreatic cancer[J].Hepatogastroenterology,1995,42(5):734-739.

[3]何效東,董家鴻,蔡景修,等.門靜脈轉流下入肝血流阻斷動物模型的建立及評價[J].西北國防醫(yī)學雜志,1999,20 (3):175-177.

[4]元文勇,余偉平,葉啟發(fā),等.大鼠肝臟缺血再灌注損傷程度判定指標的選擇[J].中國普通外科雜志,2008,17 (7): 650-653.

[5]穆振國,王海水,穆童,等.保留半肝動脈血供聯(lián)合肝缺血預處理在肝硬化復雜肝切除術中的應用[J].中國現(xiàn)代普通外科進展，2010,13 (7): 550-553.

[6]Tashiro S,Uchino R,Hiraoka T,et al.Surgical indication and significance of portal vein resection in biliary and pancreatic cancer[J].Surgery,1991,109 (4): 481-487.

[7]趙建勇,董家鴻,詹國清,等.豬單純門靜脈血流阻斷安全時限的研究[J].第三軍醫(yī)大學學報,2001，23(8)：965-967.

[8]丁鈞,董家鴻,楊占宇,等.家豬常溫下耐受入肝血流阻斷安全時限的研究[J].中華實驗外科雜志,2004,21(3): 311-313.

[9]黃波,別平,馮春林,等.腸腔分流條件下豬單純門靜脈阻斷的安全時限[J].第三軍醫(yī)大學學報,2008,30 (24): 2299-2301.