從分化胚胎干細(xì)胞中分選血管構(gòu)建種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

岳偉 曹誼林 張文杰

從分化胚胎干細(xì)胞中分選血管構(gòu)建種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

岳偉 曹誼林 張文杰

目的 本研究主要比較了應(yīng)用免疫磁珠（MACS）和流式細(xì)胞儀（FACS）兩種分選手段，從ES分化細(xì)胞中獲得血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的效率。方法 利用MACS和FACS從ES分化細(xì)胞中分選出FLK-1陽性細(xì)胞，分別在VEGF和PDGF誘導(dǎo)培養(yǎng)下獲得血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用MACS和FACS進(jìn)行細(xì)胞性質(zhì)和純度鑒定，并對(duì)兩種方法所獲細(xì)胞的活力和細(xì)胞得率進(jìn)行比較研究。結(jié)果 利用MACS分選獲得的FLK-1陽性細(xì)胞經(jīng)過PDGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后可以得到108～109量級(jí)和純度超過90%的血管平滑肌細(xì)胞，可滿足構(gòu)建血管的需要，而利用FACS分選難以獲得構(gòu)建血管肌層所需的大量細(xì)胞。利用FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞經(jīng)過VEGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后的純度約60%，表達(dá)vWF和吸收低密度脂蛋白（Ac-LDL）的血管內(nèi)皮細(xì)胞；而利用MACS從ES細(xì)胞中分選獲得的血管內(nèi)皮細(xì)胞純度較低，兩種分選方法獲得的細(xì)胞活力無明顯差別。結(jié)論 因組織工程血管構(gòu)建所需要的平滑肌細(xì)胞數(shù)量巨大，宜選用MACS從ES分化細(xì)胞中分選獲得；而血管內(nèi)皮細(xì)胞宜選用FACS分選獲得。

免疫磁珠 流式細(xì)胞儀 純化 胚胎干細(xì)胞 組織工程

以組織工程技術(shù)在體外構(gòu)建血管，是今后臨床血管缺損修復(fù)的發(fā)展方向，其中種子細(xì)胞的來源至關(guān)重要。自體血管或骨髓內(nèi)皮細(xì)胞可以作為構(gòu)建血管的種子細(xì)胞來源[1-4]，但由于采集手術(shù)本身產(chǎn)生創(chuàng)傷，而且得到的種子細(xì)胞數(shù)量有限，體外擴(kuò)增困難，無法滿足構(gòu)建血管的需要；通過基因操作來擴(kuò)增細(xì)胞的方法[5]，存在致瘤性等安全隱患。胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ES）具有分化的全能性和無限增殖能力[6-7]，為體外構(gòu)建血管提供了可能，成為具有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞來源之一。

小鼠ES細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后可形成成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，利用細(xì)胞表面標(biāo)記Flk-1可以將血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的前體細(xì)胞從分化的小鼠ES細(xì)胞中分離出來[8-10]。本實(shí)驗(yàn)探討利用免疫磁珠（MACS）和流式細(xì)胞儀（FACS）從分化ES細(xì)胞中分選獲得血管構(gòu)建所需兩種種子細(xì)胞的可行性，為血管構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM和IMDM培養(yǎng)基，PBS緩沖液，胰蛋白酶（Gibco 公司，美國）；胎牛血清（FBS）（Hyclone 公司，美國）；生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD31，生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠FLK-1，羊抗兔 IgG-FITC，strepavidin-PE（Pharmingen公司，美國）：鼠抗人SM-actin單克隆抗體（Sigma公司，美國），鼠抗人SM-MHC單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma公司，美國）；倒置相差顯微鏡（IMT-1型）和熒光倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；培養(yǎng)皿（Falcon 公司，美國）；EPICS ALTRA流式細(xì)胞分選儀（Beckman公司，美國）；免疫磁珠（Stem cell公司，加拿大）。

1.3 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及分化

本實(shí)驗(yàn)使用的是R1-ES細(xì)胞株，用含有LIF（白血病抑制因子）和處理過的MEF（胎鼠成纖維細(xì)胞）作為飼養(yǎng)層來阻止細(xì)胞分化。ES細(xì)胞選用擬胚體（Embryoid body，EB）分化方式，以（2～3）×104cells/mL的細(xì)胞接種于Petri培養(yǎng)皿。

1.4 MACS分選FLK-1陽性細(xì)胞

細(xì)胞分組：包括1個(gè)不加任何抗體的未染色細(xì)胞組、1個(gè)一抗空白對(duì)照組、1個(gè)同型對(duì)照組、2個(gè)單一染色實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)細(xì)胞分選組。一抗分別滴加生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠FLK-1（1∶200），空白組不加一抗，二抗滴加 Streptavidin-PE（1∶1 500），加入10 μL/mL Mouse FcR Blocker 和 15 μL/mL Sca1PE Labeling Reagent避免非特異結(jié)合?？乖贵w結(jié)合后，加入100 μL/mL EasySep PE、Selection Cocktail EasySep Magnetic Nanoparticles和Nanoparticles進(jìn)行FLK-1陽性細(xì)胞的分選。二次分選需重復(fù)上述步驟。分選結(jié)束后用FCAS進(jìn)行純度鑒定。

1.5 FACS分選FLK-1陽性細(xì)胞和分析

細(xì)胞分組同MACS分選。一抗分別滴加生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠FLK-1（1∶200）、生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠 PECAM1（1∶200）和鼠抗人 SM-actin 單克隆抗體(1∶200)，空白組不加一抗。結(jié)合細(xì)胞內(nèi)抗原SM-actin前樣品需要用0.01%Triton破膜1 min。二抗分別滴加 Streptavidin-PE（1∶1 500）和 FITC 抗小鼠IgG（1∶200）。分選過程中及結(jié)束后進(jìn)行純度鑒定，保證分選質(zhì)量。

1.6 FLK-1陽性細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)

MACS和FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞都接種于0.1%白明膠鋪盤的培養(yǎng)皿中。血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)用50 ng/mL VEGF+EGM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)液，血管平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)用10 ng/mL PDGF+含10%血清的IMDM。

1.7 血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞免疫熒光鑒定

將細(xì)胞爬片分實(shí)驗(yàn)組（滴加一抗）、空白對(duì)照組（未加一抗），并以小鼠成纖維細(xì)胞作陰性對(duì)照組，以小鼠平滑肌細(xì)胞作陽性對(duì)照組。一抗分別滴加生物素結(jié)合的大鼠抗小鼠 PECAM1（1∶200），兔抗人 vWF（1∶50）、鼠抗人 SM-actin 單克隆抗體 (1∶200)、鼠抗人SM-MHC(1∶100)和鼠抗人 Calponin單克隆抗體(1∶200)，空白組不加一抗滴加PBS；空白組滴加PBS；置濕盒內(nèi)，4℃冰箱內(nèi)過夜；分別依據(jù)不同一抗滴加不同第二抗體，如 Streptavidin-PE（1∶500）、羊抗鼠 IgG-FITC（1∶200）、羊抗兔 IgG-FITC（1∶200）和FITC 抗小鼠 IgM（1∶200）。Hochest核襯染 30 sec,甘油封片。樣品在Olympus IX50熒光倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MACS與FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞得率及細(xì)胞增殖能力比較

本實(shí)驗(yàn)中，我們分別運(yùn)用MACS與FACS將第4天EB細(xì)胞的FLK-1陽性細(xì)胞（圖1A）分選出來，并進(jìn)行純度鑒定（圖1B-C）。從分選得率來看，MACS比FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞得率低（圖1D），但由于MACS一次可以分選巨量的細(xì)胞，即使為獲得高純度細(xì)胞經(jīng)過兩輪，也可以得到108量級(jí)的細(xì)胞，而總分選時(shí)間并不明顯延長。FACS分選時(shí)，為了保證細(xì)胞分選后有較高的活力，必需控制分選時(shí)程在6 h以內(nèi)。在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)，MACS與FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的增殖能力均無明顯差別（P>0.05）（圖1E）。本結(jié)果提示，盡管FACS分選細(xì)胞得率較高，但分選細(xì)胞總數(shù)是有限的，不大適合巨量活力細(xì)胞的分選。

2.2 MACS分選FLK-1陽性細(xì)胞及誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞

運(yùn)用MACS將第4天EB細(xì)胞的FLK-1陽性細(xì)胞分選出來進(jìn)行誘導(dǎo)分化，鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞表型表達(dá)情況（圖2A-D），飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF作為陰性對(duì)照，本實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，培養(yǎng)4 d的FLK-1陽性細(xì)胞絕大多數(shù)都呈 SM α-actin、SMSMC和Calponin陽性，流式細(xì)胞定量分析顯示，在有或無PDGF的條件下SM α-actin陽性率都超過90%，但在有PDGF的條件下分化的平滑肌細(xì)胞表型維持較好，其陽性率可以接近96%（圖2B）。

FACS分選時(shí)，在有PDGF的條件下誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞大多表達(dá)SM α-actin、SM-SMC和 Calponin染色（圖2E-H），陽性率 95%左右（圖3A，B），與MACS分選后誘導(dǎo)分化的平滑肌細(xì)胞無明顯區(qū)別。

2.3 FACS和MACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞

FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞（陽性率>90%）種植在有0.1%白明膠鋪盤的培養(yǎng)皿中，4 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，以聚合方式生長的橢圓形細(xì)胞居多。鑒定結(jié)果顯示，F(xiàn)ACS分選的細(xì)胞誘導(dǎo)的CD31陽性率接近60%（圖3D），這些CD31陽性細(xì)胞吸收Ac-LDL（圖2E）并表達(dá) vWF（圖2F），具備血管內(nèi)皮細(xì)胞的基本功能。在同樣培養(yǎng)條件下，MACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞的效率較FACS分選的誘導(dǎo)效率低（圖3A），吸收Ac-LDL的細(xì)胞少（圖3B），vWF表達(dá)效果也較差（圖3C）。

圖1 MACS與FACS分選的FLK-1陽性細(xì)胞得率及細(xì)胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of the FLK-1+cell purity and cell proliferation capacity by MACS and FACS sorting

圖2 MACS與FACS分選后血管平滑肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化Fig.2 Vascular smooth muscle cells induction sorted by MACS and FACS

圖3 MACS與FACS分選后血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化Fig.3 Inducing differentiation of FLK-1 cells to vascular endothelial cells by MACS and FACS

3 討論

構(gòu)建組織工程化血管的種子細(xì)胞主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，而小鼠ES細(xì)胞在體外具有分化的全能性和無限增殖能力，利用細(xì)胞表面標(biāo)記Flk-1可以將血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的前體細(xì)胞從分化的小鼠ES細(xì)胞中分離出來，進(jìn)一步通過改善培養(yǎng)條件，經(jīng)誘導(dǎo)分化后可產(chǎn)生成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[8-10]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了從ES細(xì)胞單一來源可以獲得組織工程血管構(gòu)建所需要的兩種種子細(xì)胞，可利用MACS分選獲得構(gòu)建血管所需巨量的血管平滑肌細(xì)胞，而血管內(nèi)皮細(xì)胞宜選用FACS分選獲得。本研究結(jié)果為構(gòu)建具有正常結(jié)構(gòu)和功能的血管建立了基本條件。

自Choi等[11]首次從小鼠 ES分化 3.0～3.25 d的細(xì)胞中找到一種 Flk-1+血管前體細(xì)胞（Hemangioblast），并證明它能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁周細(xì)胞以來，目前關(guān)于ES細(xì)胞向血管細(xì)胞誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)技術(shù)已相對(duì)成熟[12-14]。但這些來源的血管細(xì)胞增殖能力較有限，為了獲得足夠數(shù)量的血管內(nèi)皮細(xì)胞，有研究采取了將ES分化來源的細(xì)胞進(jìn)行基因操作的方法[15-16]，雖然這樣可以獲得大量的血管細(xì)胞，但同時(shí)這些經(jīng)過病毒基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞有過度增殖的能力，從而可能導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。因此，該方法并非由ES細(xì)胞獲得血管細(xì)胞的最佳選擇。構(gòu)建組織工程化血管的種子細(xì)胞主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，其中平滑肌細(xì)胞對(duì)于在組織工程化血管生物力學(xué)的維持、血管的改建和重塑中起著決定性的作用，血管構(gòu)建時(shí)細(xì)胞需要量巨大。目前常用的獲得上述兩種種子細(xì)胞的方法是從正常的動(dòng)、靜脈中分離獲得，會(huì)造成供區(qū)血管的損害，并且操作繁瑣。ES細(xì)胞在類胚體分化系統(tǒng)內(nèi)具有強(qiáng)大的增殖能力，并且在適當(dāng)階段可以分化出較高比例的Flk-1陽性細(xì)胞，為體外構(gòu)建血管所需要大量功能正常的血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞提供了可能。本實(shí)驗(yàn)中，利用MACS一次可以大量分選細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，我們以Flk-1作為細(xì)胞表面標(biāo)記在類胚體分化階段獲得足夠數(shù)量和純度的平滑肌細(xì)胞，可以滿足組織工程化血管肌層構(gòu)建的需要。我們還運(yùn)用FACS從4 d的EB細(xì)胞中分選出來FLK-1陽性細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化血管平滑肌細(xì)胞研究，盡管誘導(dǎo)的細(xì)胞具有較高的平滑肌細(xì)胞的表型，而依據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，利用流式細(xì)胞分選時(shí)程最好控制在6 h以內(nèi)，超過這個(gè)時(shí)間范圍，利用FACS分選后的細(xì)胞活力就明顯降低。因此，通過FACS分選細(xì)胞數(shù)量是有限的，它不適合從ES分化細(xì)胞中純化大量血管平滑肌細(xì)胞。而血管內(nèi)皮細(xì)胞，因其對(duì)于維持血管通暢尤其重要、又最具有活性，對(duì)于構(gòu)建血管所需的的要求很高，而運(yùn)行平穩(wěn)的流式細(xì)胞分選平臺(tái)則可以穩(wěn)定地獲得較高純度的細(xì)胞亞群，分選純度可控。我們的研究結(jié)果證實(shí)，利用FACS獲得的血管內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)陽性率較高，接近60%。因此，從ES分化細(xì)胞中獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞宜選用了FACS，以提高分選細(xì)胞的純度和質(zhì)量。另外，為了保證細(xì)胞分選后有較高的活力，F(xiàn)ACS分選時(shí)程最好控制在5 h以內(nèi)，這樣分選出的FLK-1陽性細(xì)胞純度和增殖能力都是比較可靠的，后期誘導(dǎo)分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞純度也比較穩(wěn)定，但如果要獲得純度更高的成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞則需要改變分選策略，比如利用CD31直接將內(nèi)皮細(xì)胞從類胚體中分選出來。目前為止，尚沒人嘗試過這種純化血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。我們正在對(duì)CD31在ES細(xì)胞及其類胚體分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究，未來考慮嘗試將ES分化細(xì)胞標(biāo)記CD31后，再利用FACS直接將內(nèi)皮細(xì)胞純化出來用于血管構(gòu)建。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)比較了利用MACS與FACS從ES分化細(xì)胞中獲得足夠數(shù)量，且功能正常的的血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，通過研究，進(jìn)一步明確了選用不同手段獲得血管構(gòu)建所需的不同種子細(xì)胞的方案，為下一步構(gòu)建出有功能活力的血管創(chuàng)造了基本條件。

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Purification of Vascular Cells with MACS and FACS for Constructing Vessel from Differentiated Mouse Embryonic Stem Cells

YUE Wei1,2,CAO Yilin1,ZHANG Wenjie1.1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Time Plastic Surgery Hospital,Shanghai 200021,China.

ZHANG Wenjie(E-mail：wenjieboshi@yahoo.com.cn).

ObjectiveTo compare the efficiency between using FACS and MACS for purification of smooth muscle cells and endothelial cells induced from differentiated mouse embryonic stem cells.MethodsFLK-1+cells were sorted from EBs by FACS and MACS,and were subsequently induced to vascular endothelial cells and smooth muscle cells with PDGF and VEGF respectively.Cells were then characterized by immunefluoresence staining and FACS.ResultsLarge amount of vascular smooth muscle cells could be obtained from FLK-1 positive cells sorted by MACS.Over 90%of these cells were positive for smooth muscle markers,including SM α-actin,SM-SMC and Calponin.However,low output of smooth cells was observed by FACS sorting.Nearly 60%of cells expressed endothelial cell markers CD31 and vWF after VEGF induction of sorted cells by FACS,but low purity of endothelial cells was achieved from MACS sorting.ConclusionLarge quantity of vascular smooth muscle cells with high purity can be obtained by MACS selection of FLK-1+cells from EBs while high quality of vascular endothelial cells could be achieved by FACS sorting.

MACS;FACS;Purification;Embryonic Stem Cells;Tissue Engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）01－0001－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.01.001

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2005CB522700，2007CB948004，2011CB964704，2010CB944804）； 國家自然科學(xué)基金（30571925，30671051）；上海市曙光人才計(jì)劃（06SG22）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（岳偉，曹誼林，張文杰）；200021 上海市 上海時(shí)光整形外科醫(yī)院（岳偉）

張文杰（E-mail：wenjieboshi@yahoo.com.cn）。

2010年12月20日；

2011年1月9日）