牛血清白蛋白和苯甲酸鈉相互作用的熒光光譜研究

王志軍，鄭 靜，王慧慧

(長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011)

牛血清白蛋白和苯甲酸鈉相互作用的熒光光譜研究

王志軍，鄭 靜，王慧慧

(長治學(xué)院 化學(xué)系，山西 長治 046011)

利用熒光光譜研究了牛血清白蛋白(BSA)與苯甲酸鈉(SB)的相互作用，結(jié)果表明，隨著苯甲酸鈉濃度的增加，BSA熒光強度逐漸減弱。二者以1:1的結(jié)合比結(jié)合，考察了不同pH、離子強度、不同金屬離子，表面活性劑的條件下，苯甲酸鈉與BSA的結(jié)合情況。

苯甲酸鈉；牛血清白蛋白；熒光光譜

苯甲酸鈉(sodium benzoate)，又稱安息香酸鈉，是苯甲酸的鈉鹽。在酸性食品中能部分轉(zhuǎn)為有活性的苯甲酸，有防止變質(zhì)發(fā)酸、延長保質(zhì)期的效果，由于比苯甲酸更易溶于水，而且在空氣中穩(wěn)定，抑制酵母菌和細菌的作用強，所以使用很廣泛[1]。苯甲酸鈉對人的長期毒性尚不很明確，特別是嬰兒是否含有把苯甲酸鈉轉(zhuǎn)化為馬尿酸的轉(zhuǎn)化酶系未知[2]，因此研究苯甲酸鈉的毒性具有現(xiàn)實意義。

牛血清白蛋白(BSA)，是牛血清中的一種球蛋白，主要起維持滲透壓作用、pH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用。作為血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，它能與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)廣泛結(jié)合，還能結(jié)合大、中、小分子化合物，具有重要的生理意義[3-4]，在生命體內(nèi)起著重要的儲存和運輸作用。苯甲酸鈉與血清白蛋白間的相互作用已有報道[3]，但生命是一個復(fù)雜體系，生命過程中的物質(zhì)分子間相互作用遠不僅限于二者之間。文章研究了在不同化學(xué)環(huán)境中，苯甲酸鈉與牛血清白蛋白的相互作用，以期說明二者作用受各種條件的影響，為二者在體內(nèi)可能的作用模式提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

雷磁PH-3B型pH計(上海精科)，TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)-4600熒光儀(日本日立)，F(xiàn)A電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

牛血清白蛋白(BSA)(北京奧特星生物有限責(zé)任公司)，三羥基氨基甲烷(Tris)(湖南湘中化學(xué)試劑有限公司)，十二烷基苯磺酸鈉(SDS)(成都市科龍化工試劑廠)，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(中國湘中地質(zhì)實驗研究所)，Triton X-100(河南天方藥業(yè)有限公司)。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 光譜測定

稱取一定量的牛血清白蛋白，加入一定量的Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.4，其準(zhǔn)確濃度用吸收光譜法測定。BSA工作濃度3.57×10-7mol/L。掃面300nm-500nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)波長是290nm，狹縫寬度均為2.5nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯甲酸鈉與BSA作用的熒光光譜分析

圖1為苯甲酸鈉存在下，牛血清白蛋白的熒光光譜圖。由圖知，牛血清白蛋白隨著苯甲酸鈉濃度的增加，在340nm處熒光強度降低，且有明顯藍移。當(dāng)苯甲酸鈉加入一定量時，熒光強度幾乎不變。表明苯甲酸鈉與牛血清白形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，在靜態(tài)猝滅中，熒光體的熒光強度與其游離濃度成正比，利用lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q][3]，以lg(F0-F/F)對lg[Q]作圖得到一條直線，根據(jù)直線斜率及截距分別求得結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點數(shù)n，計算得出y=0.8116x+3.6705，n=0.8116，約等于 1，即苯甲酸鈉與BSA結(jié)合比為1:1[3]，和文獻報道相符合。

2.2 pH對苯甲酸鈉-BSA熒光光譜的影響

pH對苯甲酸鈉和BSA相互作用的熒光強度密切相關(guān)。圖2可知，在pH=5.4的時候苯甲酸鈉與BSA相互作用的熒光光譜的強度最大，pH大于5.4時，隨著pH的增加，熒光強度隨之減弱。然后pH小于5.4，熒光強度也降低。溶液pH的變化對一定配比的苯甲酸鈉和BSA有很大的影響。這是因為苯甲酸鈉-BSA是弱酸性或弱堿性物質(zhì)，溶液對PH的改變非常靈敏，且在等電點附近，BSA不帶電荷，對pH的改變影響較小。

2.3 金屬離子對苯甲酸鈉-BSA熒光光譜的影響

金屬元素在有關(guān)生命過程中起著極其重要的作用，如鉻、鎳是生物體所必需的微量元素之一，鉻是生物必需的微量元素，在酶的催化和加強糖代謝等方面具有重要作用,鉻在動物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運機制仍不確定[5]，鉻(Ⅲ)是環(huán)境中常見的重金屬污染物，是一種毒性較大的制畸、致突變劑，被國際癌癥研究機構(gòu)歸為一類人類職業(yè)致癌物。銅是人體的必須元素[6]，銅作為各種金屬酶的活性中心，催化電子轉(zhuǎn)移、氧化反應(yīng)和氧合反應(yīng)，也是生物體作為載體氧蛋白活性部位的基本成分。鐵元素是人體含量最多的必須微量元素[7]，它是多種蛋白質(zhì)和酶類的關(guān)鍵組分，在人體中具有造血功能，并且參與血蛋白、細胞色素及各種酶的合成，同時還在血液中起運輸氧和營養(yǎng)物質(zhì)的作用。人的顏面泛出紅潤之美，也離不開鐵元素，人體缺鐵會發(fā)生小細胞性貧血、免疫功能下降和新陳代謝紊亂，如果鐵質(zhì)不足可導(dǎo)致缺鐵性貧血。但重金屬元素在高濃度下是有毒的，對不同金屬離子對苯甲酸鈉與牛血清白蛋白的影響做了研究。結(jié)果表明，如圖3，Cu2+，Ni2+，F(xiàn)e3+，Cr3+均對BSA與苯甲酸鈉相互作用的熒光光譜產(chǎn)生協(xié)同猝滅作用，均能提高BSA與苯甲酸鈉的結(jié)合能力。猝滅作用從強到弱依次為Cr3+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Ni2+。這可能是由于金屬離子與BSA及苯甲酸鈉形成了三元配合物，帶電的蛋白質(zhì)和苯甲酸鈉以及金屬離子通過靜電作用相互吸引到蛋白質(zhì)的表面，從而引起熒光猝滅。Fe3+、Cr3+電荷數(shù)高，離子半徑小，靜電作用強更有利于配合物的形成，但濃度較高時由于離子強度的增大使這種結(jié)合受到一定程度的影響。Cu2+，Ni2+影響次之。

2.4 表面活性劑對苯甲酸鈉-BSA熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)——表面活性劑復(fù)配體系不僅在藥物、化妝品、生物及食品等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，而且還可用于模擬生物體系，對加快生物技術(shù)向化工、醫(yī)藥等傳統(tǒng)領(lǐng)域的滲透和應(yīng)用具有重要的意義。如圖4可知，表面活性劑對一定配比的苯甲酸鈉和BSA相互作用的溶液的熒光強度有明顯的影響作用。其中CTAB使得熒光明顯增強，有敏化作用，其次是十二烷基苯磺酸鈉(SDS)，也有一定的敏化作用，而Triton X-100及PEX則使熒光強度減弱。

這可能是由于離子型表面活性劑在其濃度低于CMC(臨界膠束濃度)時，對體系有不同程度的增強作用，當(dāng)其濃度超過CMC時，對體系有不同程度的抑制作用。所以陽離子表面活性SDS、陰離子表面活性劑CTAB使得熒光強度增強，而陰離子表面活性劑PEX則使熒光光譜猝滅。非離子表面活性劑表面不帶電荷，與蛋白質(zhì)的相互作用通常是很弱的，有的甚至沒有作用，所以熒光強度減弱[9]。因此，Triton X-100對苯甲酸鈉-BSA的熒光光譜稍有猝滅，或幾乎沒影響。

2.5 離子強度對苯甲酸鈉-BSA熒光光譜的影響

如圖5所示，氯化鈉對苯甲酸鈉與BSA相互作用的熒光強度有一定的影響。隨著氯化鈉濃度的增加，熒光強度在逐漸減弱。這是由于隨著氯化鈉的加入，在BSA周圍的Cl-增多，從而減弱苯甲酸鈉與BSA之間的結(jié)合，引起熒光強度的稍稍減弱。

3 結(jié)論

通過熒光光譜，監(jiān)測了牛血清白蛋白和苯甲酸鈉的相互作用。實驗結(jié)果表明：苯甲酸鈉的加入能降低牛血清白蛋白的熒光，二者形成了穩(wěn)定的復(fù)合物；在pH=5.4時，二者作用最強；金屬離子的加入亦猝滅復(fù)合物的熒光強度，作用從強到弱依次為Cr3+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Ni2+；表面活性劑 SDS 和 CTAB 敏化復(fù)合物熒光，PEX則強烈猝滅熒光。離子強度的變化對二者的作用也有一定的影響。通過上述研究，為尋找二者最佳的結(jié)合條件提供一定的理論依據(jù)。

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Study of Interaction Between Bovine Serum Albumin with Sodium Benzoate by Fluoresence Spectroscopy

WANG Zhi-jun，ZHENG Jing，WANG Hui-hui
(Department of Chemistry，Changzhi University，Changzhi，Shanxi 046011)

The interaction of bovine serum albumin(BSA)with sodium benzoate were studied by the fluorescence spectra.The results showed that fluorescence intensity decreased gradually with increasing concentration of sodium benzoate，sodium benzoate binds BSA by 1:1.The binding of sodium benzoate and BSA were measured in the presence of different pH，ionic strength，different metal ions and surfactant conditions.

bovine serum albumin；fluorescence spectroscopy；sodium benzoate

O657.39

A

1673-2014(2011)05-0008-04

2011—04—11

山西省高校科技開發(fā)項目(20081042)；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目；長治學(xué)院校級資助項目(2011116)。

王志軍(1980—)，男，山西原平人，副教授，博士，主要從事生物無機化學(xué)研究工作。

(責(zé)任編輯 王璟琳)