質(zhì)粒pBR322DNA與內(nèi)切酶EcoRI相互作用的研究

張志勇，王艷偉，楊光參

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江溫州 325035)

質(zhì)粒pBR322DNA與內(nèi)切酶EcoRI相互作用的研究

張志勇，王艷偉，楊光參?

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江溫州 325035)

借助原子力顯微鏡（AFM）對DNA與內(nèi)切酶的切割與結(jié)合作用進(jìn)行研究．當(dāng)緩沖液中有Mg2+存在時，內(nèi)切酶EcoRI會在單一識別位點(diǎn)處切割pBR322DNA，如果緩沖液中的Mg2+用Ca2+代替，內(nèi)切酶EcoRI則會與pBR322DNA在單一識別位點(diǎn)處結(jié)合，并且切割率與結(jié)合率都隨著內(nèi)切酶濃度的增加而增加．

DNA；內(nèi)切酶；切割；結(jié)合

DNA是生物體的遺傳物質(zhì)，同時也是染色體的主要組成部分[1-2]．限制性內(nèi)切酶是生物學(xué)中廣為使用的一種工具酶，能使多核苷酸鏈發(fā)生斷裂，但是它只對脫氧核糖核酸內(nèi)的一定堿基序列中的某一特定位置發(fā)生作用，把這個特定位置的鏈切開，所以通過內(nèi)切酶可以將某一個遺傳基因給切下來[3-5]．如果再將這一基因連在其它細(xì)胞遺傳基因上，組成新細(xì)胞，則該新細(xì)胞會具有新的遺傳特性與功能．因此，限制性內(nèi)切酶的存在使DNA分子之間的重組成為了可能．

DNA與內(nèi)切酶的相互作用在生物學(xué)中有重要意義．DNA與蛋白質(zhì)分子相結(jié)合的精確位點(diǎn)圖譜和不同細(xì)胞狀態(tài)下結(jié)合位點(diǎn)的測定對研究復(fù)雜細(xì)胞體系的機(jī)理與功能,特別是基因表達(dá)的控制是十分關(guān)鍵的．原子力顯微鏡（AFM）高度分辨率可達(dá)0.1 nm，寬度分辨率可達(dá)2 nm，已廣泛用于表征各種DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物．原子力顯微鏡中，云母是研究DNA構(gòu)象變化和DNA-蛋白質(zhì)相互作用的常見基底[6-7]，其表面具有原子級別的平整度，而且?guī)в胸?fù)電荷，有利于吸附在表面的核酸的處理，這也是原子力顯微鏡廣泛應(yīng)用于納米生物科學(xué)研究的重要原因[8-9]．

帶負(fù)電的云母表面與帶負(fù)電的磷酸根骨架間有天然的排斥作用，為了消除這種作用，常在沉積緩沖液中加入二價離子[10-11]或者三價離子[12]．1983年，Terry等人[13]研究了控制EcoRI與DNA特異性作用與非特異性作用的熱動力學(xué)系數(shù)，1986年，McClarin等人[14]確定了EcoRI與DNA作用復(fù)合物的具體結(jié)構(gòu)，1999年，Wright[15]等人又進(jìn)一步提出了EcoRI與DNA結(jié)合與分離的動力學(xué)機(jī)制，這些研究結(jié)果為進(jìn)一步在云母片上面研究DNA與內(nèi)切酶的相互作用提供了主要依據(jù)．

EcoRI是一種小的內(nèi)切酶（31KDa），通過二聚體的形式與DNA發(fā)生作用，其識別序列是5’-GAATTC-3’[16]．本文利用AFM對內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用進(jìn)行研究．結(jié)果表明，內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA有單一的識別位點(diǎn)，有酶輔助因子鎂離子存在于緩沖液中時，內(nèi)切酶會對DNA有切割作用，如果緩沖液中的鎂離子用鈣離子代替，那么內(nèi)切酶的切割作用會被限制，蛋白反而會與DNA結(jié)合，并且切割率與結(jié)合率都隨著內(nèi)切酶濃度的增加而增加．

1 材料與方法

1.1 材 料

PBR322DNA（4632bp，環(huán)狀）購于NEB（北京）公司，原始濃度是500 ng·μL-1．內(nèi)切酶EcoRI購買于sigma（美國）公司，原始濃度是5 unit·μL-1．氯化鎂與氯化鈣等化學(xué)試劑都是分析純，購于北京經(jīng)科宏達(dá)公司．實(shí)驗(yàn)用水都是超純水（經(jīng)密理博超純水系統(tǒng)過濾、去離子化處理）．云母做成1 cm × 1 cm的正方形，每次用前都用透明膠重新解離，以保證云母片表面的平整度與清潔．

1.2 AFM成像

本文使用的AFM是日本京都島津公司生產(chǎn)的，型號為SPM-9600．文中所有圖像都是在空氣中采用輕敲模式獲得的，掃描速度都是3 Hz，圖片像素都是512 × 512．AFM圖像中關(guān)于DNA高度、寬度等信息的分析都是從SPM-9600自帶的離線分析軟件獲得的．

1.3 AFM樣品準(zhǔn)備

1）用移液器量取200 μL緩沖液（20 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1MgCl2·6H2O或者20 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1CaCl2·6H2O）放入離心管中，貼上標(biāo)簽．向緩沖液中加入0.5 μL的λ-DNA（500 ng·μL-1）與不同量的EcoRI（5 unit·μL-1）內(nèi)切酶輕彈混勻．再將離心管置于37℃的干式恒溫箱內(nèi)放置30分鐘．

2）用移液器吸取20 μL離心管中的混合液，滴在已經(jīng)處理過的云母片上，蓋上玻璃罩，防止灰塵落入影響成像的效果，沉積2分鐘（使用計時器計時）．沉積2分鐘后用超純凈水洗滌云母表面的樣品，用移液器吸取超純凈水，從云母片的一端滴，再從云母片的另一端吸，在洗滌過程中，移液器的槍頭不要觸碰云母片，以防破壞云母片，不利于觀察，此過程重復(fù)10 – 15次．接著用氮?dú)鈱悠反蹈?，在吹的過程中吹的方向與洗滌的方向保持一致．

3）用以上的步驟制作多個樣品，樣品按照順序標(biāo)記好，記錄每個樣品的具體時間與條件．最后將樣品放在玻璃皿中，在室溫干燥箱內(nèi)干燥2個小時以上．將制好樣品放于AFM下觀察成像．

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)切酶與DNA的切割作用

有關(guān)內(nèi)切酶與DNA作用的研究與討論很多，大多數(shù)內(nèi)切酶與DNA的相互作用都需要Mg2+作為催化輔助因子[17-19]．有鎂離子存在時，內(nèi)切酶具有很大的切割活性，內(nèi)切酶會識別DNA4-8堿基對的特異序列，然后在這個識別位點(diǎn)上或者附近切割 DNA[20-22]．本文利用 AFM 對內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用進(jìn)行研究，用含有Mg2+的緩沖液實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，環(huán)狀的DNA被切開，變成線狀結(jié)構(gòu)，并且只有一個斷口．從圖1還可以看出，隨著內(nèi)切酶濃度的增加，DNA被切割的數(shù)目也在增加．

從切割后不同DNA結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計圖（圖1的D、E、F）可以看出，剛開始內(nèi)切酶濃度較小時，內(nèi)切酶濃度增加對切割率的影響不是很大，當(dāng)內(nèi)切酶的濃度大于5 unit·μL-1時，DNA被切割的比例明顯增加．

圖1 有Mg2+存在的條件時, 內(nèi)切酶EcoRI與DNA的切割作用圖

2.2 內(nèi)切酶與DNA的結(jié)合作用

用含有Ca2+的緩沖液代替Mg2+緩沖液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示．從圖2中可以清晰看見DNA上面有結(jié)合的內(nèi)切酶，并且內(nèi)切酶的濃度越大，其與DNA的結(jié)合率越高．內(nèi)切酶的濃度比較低時，DNA上面的內(nèi)切酶很少，只有個別DNA上面有一個結(jié)合的內(nèi)切酶，隨著內(nèi)切酶濃度的增加，每個DNA上面幾乎都有結(jié)合的內(nèi)切酶酶，而且不止一個（這是由一些非特異性的結(jié)合導(dǎo)致的，不止在識別位點(diǎn)與DNA結(jié)合），甚至當(dāng)內(nèi)切酶的個數(shù)多到一定程度，DNA之間因?yàn)閮?nèi)切酶的作用會發(fā)生交聯(lián)，或者凝聚．由此可見，有Ca2+存在時，內(nèi)切酶的切割作用被限制，內(nèi)切酶與DNA的特異性識別位點(diǎn)有結(jié)合作用．與濃度對切割率的影響不同，剛開始內(nèi)切酶濃度較小時，內(nèi)切酶濃度增加對結(jié)合率的影響就很大，在內(nèi)切酶的整個實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，結(jié)合率都在隨內(nèi)切酶濃度的增加而快速增加．有鈣離子存在時，內(nèi)切酶可以結(jié)合到DNA的特定位點(diǎn)，這在基礎(chǔ)生物化學(xué)中有重要意義．

內(nèi)切酶與DNA的特異性識別位點(diǎn)有結(jié)合作用，是因?yàn)橛蠧a2+存在時，內(nèi)切酶與DNA作用會產(chǎn)生特異性蛋白-金屬-DNA復(fù)合物[20-22]，這種穩(wěn)定的三元復(fù)合物會阻礙內(nèi)切酶對DNA的切割作用，增加兩者的結(jié)合性．

圖2 有Ca2+存在時, 內(nèi)切酶EcoRI與DNA的結(jié)合作用圖

3 結(jié) 論

內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的相互作用主要有兩種，它們之間有單一的特異性識別位點(diǎn)．在有酶輔助因子鎂離子存在時，內(nèi)切酶對DNA有切割作用，環(huán)狀DNA被切成線狀，而且只有一個斷口；如果用鈣離子代替鎂離子實(shí)驗(yàn)，內(nèi)切酶的切割作用就會被限制，蛋白會在識別位點(diǎn)處與DNA結(jié)合，一根DNA上面會結(jié)合一個內(nèi)切酶的二聚體．內(nèi)切酶EcoRI與質(zhì)粒pBR322DNA的結(jié)合率與切割率都隨內(nèi)切酶的濃度增加而增加，結(jié)合率增加的速度更快一些．

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Study on Interaction between Plasmid pBR322DNA and Endonuclease EcoRI

ZHANG Zhiyong, WANG Yanwei, YANG Guangcan
(College of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou, China, 325035)

The interaction of cleaving and binding between DNA and endonucleases EcoRI was observed by atomic force microscope (AFM). The findings showed that in the presence of Mg2+in buffer, endonucleases EcoRI can cleave pBR322DNA on one specific recognition site; while, if Ca2+took the place of Mg2+in buffer, endonucleases EcoRI can bind pBR322DNA on the specific recognition site. The cleaving and binding ratio would increase with the increase of concentration of endonucleases.

DNA; Endonuclease; Cleaving; Binding

(編輯：王一芳)

Q633

A

1674-3563(2011)05-0032-06

10.3875/j.issn.1674-3563.2011.05.006 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

2011-03-29

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2007CB935900)；國家自然科學(xué)基金(10974146, 20934004)；浙江省自然科學(xué)基金(Y6090222)

張志勇(1980- )，男，湖南寧遠(yuǎn)人，碩士研究生，研究方向：生物物理．? 通訊作者，yanggc@wzu.edu.cn