叢粒藻形態(tài)多樣性與遺傳多樣性研究*

王朋云,茅云翔,孔凡娜,馬 梅,馬 飛

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與基因資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

叢粒藻(Botryococcus braunii)[1],又名布朗葡萄藻,屬綠藻門(Chlorophyta)、共球藻綱(Trebouxiophyceae)、叢粒藻科(Botryococcaceae)、叢粒藻屬(Botryococcus),是1種營(yíng)聚落生活的單細(xì)胞綠藻[2]。研究發(fā)現(xiàn),叢粒藻在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠大量合成并儲(chǔ)存多種烴類物質(zhì),其總烴含量一般超過(guò)細(xì)胞干重的30%,最高可達(dá)86%[3-4]。研究還證明,叢粒藻是構(gòu)成石油生烴母質(zhì)的主要成分[5-7],所產(chǎn)生的烴類物質(zhì)熱值較高[8]。因此,該藻被認(rèn)為是一種潛在的可再生生物燃料來(lái)源。

叢粒藻廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶和溫帶的淡水和微咸水湖等水體中[9]。不同地理株系間具有形態(tài)多樣性,細(xì)胞形狀大小、膠質(zhì)鞘包埋程度、細(xì)胞排列方式、聚落細(xì)胞數(shù)目和連接方式等均存在差異,這些形態(tài)指標(biāo)是叢粒藻分屬、定種的主要指標(biāo)[10]。同時(shí),研究還證明不同來(lái)源叢粒藻合成的烴類物質(zhì)也存在顯著差異[11-13]。叢粒藻形態(tài)多樣性與生化多樣性的基礎(chǔ)在于不同來(lái)源藻株的遺傳差異。

本研究以3株不同來(lái)源的叢粒藻為實(shí)驗(yàn)材料,一方面通過(guò)觀察顯微和亞顯微結(jié)構(gòu),克隆并分析18S～28S rDNA序列特征,為叢粒藻的形態(tài)分類和分子鑒定提供系統(tǒng)的數(shù)據(jù);另一方面研究叢粒藻不同株系間形態(tài)多樣性-遺傳多樣性的關(guān)系,結(jié)合生理生化數(shù)據(jù),將為優(yōu)良藻株的遺傳選育提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藻株 實(shí)驗(yàn)中所用3株叢粒藻AGBBb01、AGB-Bb02和A GB-Bb03均來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù),其中AGB-Bb01采集自英國(guó)劍橋(原始藻株編號(hào)U TEX 572),AGB-Bb02采集自中國(guó)云南(原始藻株編號(hào)FACHB-759),AGB-Bb03采集自中國(guó)湖北(原始藻株編號(hào)FACHB-775)。藻株均培養(yǎng)于Chu10培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度(23±1)℃,光暗周期比12 h∶12 h,光照強(qiáng)度25μmol·m-2·s-1。

1.1.2 菌株和克隆載體 基因克隆載體為pMD18-T,宿主菌株為E.coli DH5α,均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑盒、工具酶和試劑 PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)購(gòu)自O(shè)M EGA公司,Taq酶等PCR試劑購(gòu)自MBI公司,試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 光學(xué)顯微鏡樣品處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液滴于載玻片上制成臨時(shí)裝片,直接在Olympus顯微鏡下觀察并顯微拍照,測(cè)量指標(biāo)包括細(xì)胞長(zhǎng)度、細(xì)胞寬度、聚落長(zhǎng)度、聚落寬度、聚落細(xì)胞數(shù)目,每株微藻觀察聚落數(shù)為30個(gè)。

1.2.2 掃描電鏡樣品處理 取1 m L對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液于圓底離心管,800 r/min離心10 min收集藻細(xì)胞,加入1 m L 1%戊二醛固定(4℃過(guò)夜),1 000 r/min離心10 min,用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次,然后依次用30%,50%,70%,90%,100%乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水,用吸管將含有樣品的乙醇溶液滴在有明膠膜的蓋玻片上,可防止細(xì)胞被沖走,采用臨界點(diǎn)干燥法干燥,離子濺射鍍膜法鍍膜[14]。

1.2.3 基因克隆 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻液,4℃下8 000 r/min離心10 min收集藻細(xì)胞,無(wú)菌水洗滌2次。將藻細(xì)胞于液氮中充分研磨后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管,用酚氯仿法提取微藻基因組DNA[15]。

根據(jù)NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的叢粒藻序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包含大部分18S rDNA、ITS區(qū)和小部分28S rDNA序列片段(見(jiàn)圖1),所用引物由上海英俊(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成。正向引物序列S1F:5’-TGCCAGTAGTCA TA TGCTT GTC-3’;反向引物序列S2R:5’-TAAGTTCAGCGGGTGCTCTTAC-3’。

圖1 叢粒藻18S～28S rDNA序列結(jié)構(gòu)和引物結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 The arrangment of the 18S～28S rDNA sequences and binding site of primers in B.braunii

PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用OM EGA凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)回收后用T4 DNA連接酶將目標(biāo)片段連接到質(zhì)粒載體pMD18-T上,轉(zhuǎn)入E.coli DH5α,由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 核酸序列分析 核酸序列同源性分析采用NCBI blastn在線程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。多序列對(duì)位分析采用Bio Edit(version 7.0.5.2)包含的Clustal Wpackage(參數(shù)設(shè)定為gap open penalty=15,gap extend penalty=6.66);系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用M EGA 3.1 Unweighted Pair-Group Method Using(NJ),Kimura 2-parameter計(jì)算遺傳距離值(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值)。

2 結(jié)果

2.1 叢粒藻細(xì)胞形態(tài)特征及不同藻株間的差異

顯微觀察發(fā)現(xiàn),3株叢粒藻藻細(xì)胞均呈黃綠色,細(xì)胞側(cè)面觀卵形或?qū)捖研?頂面觀圓形。藻細(xì)胞色素體單個(gè)片狀側(cè)生,位于細(xì)胞底部至中部;胞內(nèi)有數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)大小不等的球狀小顆粒,內(nèi)為淀粉或油滴。細(xì)胞基部埋藏于藻落的透明膠質(zhì)中,符合叢粒藻的形態(tài)學(xué)特征(見(jiàn)圖2)。藻細(xì)胞合成的烴類物質(zhì)大部分運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外,胞外烴呈顆粒狀儲(chǔ)存在細(xì)胞壁中。測(cè)量結(jié)果顯示,3株藻在細(xì)胞大小(見(jiàn)表1)、聚落大小和聚落細(xì)胞數(shù)目方面存在較明顯的差異(見(jiàn)表2)。其中,藻株AGB-Bb03細(xì)胞最大,而AGB-Bb02細(xì)胞最小;藻株A GB-Bb03聚落最大,聚落細(xì)胞數(shù)目最多,而AGBBb02聚落最小,AGB-Bb01聚落細(xì)胞數(shù)目最少。

圖2 3株叢粒藻細(xì)胞形態(tài)顯微觀察Fig.2 Mo rphological characters of different strains of B.braunii observed under lightmicroscope

表1 不同株系叢粒藻細(xì)胞大小Table 1 Cell size of different strainsof B.braunii

掃描電鏡下,可見(jiàn)藻細(xì)胞基部至中上部被母細(xì)胞壁殘余加厚形成的杯狀結(jié)構(gòu)包被,頂部裸露不具加厚的細(xì)胞壁。3株微藻杯狀鞘的厚度及細(xì)胞的包埋程度略有差別:AGB-Bb02的細(xì)胞壁較厚,AGB-Bb03次之,AGB-Bb01最薄;AGB-Bb02細(xì)胞大部分被杯狀細(xì)胞壁包埋,僅頂部小部分未被杯狀鞘包被,AGB-Bb01和AGB-Bb03的細(xì)胞包埋程度不及前者,杯狀鞘約至細(xì)胞中上部。聚落通常是由2、4、8或更多的細(xì)胞通過(guò)膠絲連接成葡萄串狀的集結(jié)體或復(fù)合集結(jié)體,膠絲長(zhǎng)短各異且形狀不規(guī)則,細(xì)胞在聚落表面略呈輻射排列(見(jiàn)圖3)。

表2 叢粒藻不同株系聚落大小和聚落細(xì)胞數(shù)目Table 2 Colony size and cell numbersof the different strains of B.braunii

圖3 3株叢粒藻細(xì)胞掃描電子顯微鏡觀察Fig.3 Morphological and structural characters of three different strains of B.braunii observed by a scanning electron microscope

2.2 叢粒藻遺傳多樣性

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子量約為2 500 bps,包含18S rDNA、ITS區(qū)和28S rDNA序列片段。采用NCB I blastn在線程序進(jìn)行核酸序列同源性分析,結(jié)果顯示3株實(shí)驗(yàn)藻株的18S-28S rDNA序列與GenBank公共核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中叢粒藻的相關(guān)序列高度相似,其中AGBBb01與B.braunii Titicaca序列相似性為91.02%,A GB-Bb02與B.braunii Songkla Nakarin序列相似性為94.42%,AGB-Bb03與B.braunii Ayame序列相似性為99.60%。結(jié)果表明3株實(shí)驗(yàn)藻株均為叢粒藻,但不同藻株間存在遺傳差異。將3株實(shí)驗(yàn)藻株的序列向GenBank公共核酸數(shù)據(jù)庫(kù)提交,獲得登錄號(hào)為GU 951518、GU 951519、GU 951520。

2.2.1 基于18S rDNA的遺傳多樣性分析 去除引物序列后,18S rDNA序列長(zhǎng)度分別為A GB-Bb01 1755bp、A GB-Bb02 1753bp,A GB-Bb03 1754bp,將本文克隆的18S rDNA序列分別與公共核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中已登錄的叢粒藻相應(yīng)序列,可以發(fā)現(xiàn)不同藻株相應(yīng)序列之間存在堿基數(shù)目的差別(見(jiàn)表3)。

遺傳距離和序列相似性分析結(jié)果顯示:8株叢粒藻中遺傳親緣關(guān)系最近的是采自湖北武漢的藻株AGBBb03與源于非洲科特迪瓦的藻株Ayame,其遺傳距離和序列相似性分別為0.001 1和0.998 3;遺傳親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是采自云南撫仙湖的藻株A GB-Bb02與源于美國(guó)明尼蘇達(dá)艾塔斯卡湖的藻株Tow 9/21 P-16w,遺傳距離和相似性分別為0.040 0和0.957 9。8株叢粒藻之間的平均遺傳距離為0.025 2,平均序列相似性為0.972 7;而與同科不同屬的Botryosphaerella sudetica U TEX 2629親緣關(guān)系最近的是藻株AGB-Bb01,二者之間的遺傳距離值為0.102 0,序列相似性為0.902 7(見(jiàn)表4)。

以與叢粒藻同科但不同屬的南向球葡萄藻Botryosphaerella sudetica U TEX 2629相關(guān)序列為外群采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,8株藻可劃分為2個(gè)簇群(見(jiàn)圖4)。在本文實(shí)驗(yàn)研究的3株微藻中,AGB-Bb02與AGB-Bb03親緣關(guān)系更近,屬于同一簇群;其中AGB-Bb03首先與源自科特迪瓦的Ayame株聚群(支持率100%,遺傳距離值0.001 1,序列相似性0.998 3),AGB-Bb02則先與源自泰國(guó)的Songkla Nakarin株聚群(支持率99%,遺傳距離值0.007 5,序列相似性0.992 6)。而AGB-Bb01則屬于另一簇群,與源于玻利維亞的Titicaca株和美國(guó)明尼蘇達(dá)的Tow 9/21 P-16w親緣關(guān)系更近(支持率為99,遺傳距離值0.009 8,序列相似性0.988 0)。藻株Ayame和AGB-Bb03的序列相似性最大(0.998 3),AGB-Bb02和Tow 9/21 P-16w的序列相似性最小(0.957 9),8株叢粒藻的序列相似性均值為0.972 7。

表3 用于系統(tǒng)樹構(gòu)建的叢粒藻18S rDNA和ITS區(qū)域的基本信息Table 3 Basic characters of 18S rDNA and ITS region of Botryococcus fo r phylogenetic tree construction

表4 基于18S rDNA序列的不同叢粒藻藻株的遺傳距離和序列相似性Table 4 Genetic distances and sequence similarities of different Bot.strains based on 18S rDNA sequences

圖4 基于18S rDNA序列的叢粒藻系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of genus Bot.based on 18S rDNA sequences using Neighbor-Joining method

2.2.2 基于ITS區(qū)序列的遺傳多樣性分析 本文克隆的3株叢粒藻ITS區(qū)序列長(zhǎng)度分別是AGB-Bb01 687bp、AGB-Bb02 613bp和AGB-Bb03 653bp。比較全部14株相關(guān)序列已知的叢粒藻,發(fā)現(xiàn)5.8S rDNA核苷酸長(zhǎng)度一致,均為159bp,顯示出遺傳上的穩(wěn)定性;但5.8S rDNA的GC含量、ITS1和ITS2長(zhǎng)度及堿基使用偏好變化很大,又顯示出藻株間的遺傳多樣性(見(jiàn)表3)。

遺傳分析顯示:在14株叢粒藻中,源于英國(guó)劍橋的藻株AGB-Bb01與源于澳大利亞新南威爾士的藻株Jillamatong具有最近的親緣關(guān)系,遺傳距離和序列相似性分別為0.002 3和0.988 4;親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是源自英國(guó)坎布里亞的CCAP807/2與科特迪瓦藻株Yamoussoukro,遺傳距離和序列相似性分別為0.494 8和0.577 4。14株叢粒藻之間的平均遺傳距離為0.327 5,平均序列相似性為0.663 9;而與近緣屬物種Botryosphaerella sudetica U TEX 2629的平均遺傳距離為0.678 0,平均序列相似性為0.463 6(見(jiàn)表5)。數(shù)據(jù)分析表明叢粒藻藻株的5.8S rDNA-ITS位點(diǎn)具有較高的遺傳多態(tài)性,可用于不同藻株基因分型研究。同時(shí)數(shù)據(jù)分析也表明,盡管種內(nèi)不同藻株之間遺傳距離較大,序列相似性也較低,但與近緣物種相關(guān)數(shù)據(jù)比較仍有顯著差異,因此該位點(diǎn)也可用于鑒定種屬間的差異。

圖5 用鄰接法重建的基于叢粒藻ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining tree of Bot.based on ITS region sequences

以B.sudetica U TEX 2629的ITS區(qū)序列為外群重建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,所有叢粒藻藻株可以分為2大簇群(見(jiàn)圖6),完全支持了18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)生樹對(duì)叢粒藻親緣關(guān)系的劃分。本實(shí)驗(yàn)研究的3株叢粒藻顯示出遺傳上的差異,AGB-Bb02和AGB-Bb03屬于同一個(gè)簇群,而AGB-Bb01屬于另一個(gè)簇群。AGBBb01與來(lái)自秘魯庫(kù)斯科的U TEX 2441及澳大利亞新南威爾士的Jillamatong聚為1個(gè)分支(支持率100,遺傳距離值0.002 3,序列相似性0.988 4);源自云南撫仙湖的AGB-Bb02先與源自泰國(guó)的Songkla Nakarin聚群(支持率93,遺傳距離值0.153 9,序列相似性0.804 4),再與來(lái)自科特迪瓦的Yamoussoukro聚在一起;源自湖北武漢的A GB-Bb03則在與A yame聚群后(支持率為100,遺傳距離值0.004 5,序列相似性0.990 9),再依次與2株來(lái)自美國(guó)明尼蘇達(dá)的FDCC CH28、CH86聚為1個(gè)分支。另外,系統(tǒng)發(fā)生樹還顯示叢粒藻2大簇群各包含7個(gè)藻株,而每個(gè)簇群又可進(jìn)一步細(xì)分為不同的亞簇,表明不同藻株之間遺傳上的多樣性。

表5 基于ITS區(qū)序列的不同叢粒藻藻株的遺傳距離和序列相似性Table 5 Genetic distances and sequence similarities of different strains based on ITS region sequences

3 討論

3.1 叢粒藻的分類鑒定技術(shù)

微藻藻種鑒定工作要求研究者具有豐富的經(jīng)驗(yàn),所依據(jù)的形態(tài)特征需要借助光學(xué)顯微鏡來(lái)觀察,某些細(xì)節(jié)特征還需進(jìn)一步借助電子顯微鏡。但由于微藻細(xì)胞形態(tài)的可塑性,在不同的環(huán)境下往往出現(xiàn)明顯的差異,因此依據(jù)形態(tài)的鑒定結(jié)果常常出現(xiàn)同種異名或同名異種的情況。利用基因序列分析判斷藻株的親緣關(guān)系是形態(tài)觀察的輔助手段,特別是形態(tài)上難以區(qū)別的藻株,二者結(jié)合能夠?qū)ξ⒃宸诸愄峁└嗟囊罁?jù),結(jié)果的準(zhǔn)確性也更有保證。

叢粒藻的鑒定方法主要有形態(tài)觀察、基因序列分析及化學(xué)成分檢測(cè)3種。根據(jù)不同地理株形態(tài)上的差別,Komarek和M arvan[16]將叢粒藻屬分為13個(gè)種。本研究也表明不同地理來(lái)源的叢粒藻藻株在細(xì)胞大小、聚落大小和聚落細(xì)胞數(shù)目方面存在較明顯的差異,電鏡觀察不同藻株的亞顯微結(jié)構(gòu)也顯示其杯狀鞘厚度及細(xì)胞包埋程度存在差異。但是否可依據(jù)這些特征將其分為不同的種,仍需開展深入的研究。

叢粒藻在代謝過(guò)程中能夠合成不同的烴類,研究發(fā)現(xiàn)不同的藻株所合成烴的種類具有特異性,因此Plain等人提出[17]將產(chǎn)烴種類相同的種歸為同一化學(xué)族(Race)。根據(jù)所合成烴類的類型,目前將叢粒藻分為A、B、L和Gb 4個(gè)化學(xué)族[18-20]。

本研究表明,叢粒藻18S rDNA位點(diǎn)具有一定的多態(tài)性,而ITS區(qū)位點(diǎn)多態(tài)性極高,因此將二者結(jié)合起來(lái)可用于從屬、種至地理株系等不同分類階元的分子鑒定。本研究依據(jù)核苷酸序列信息所有藻株可分為2大簇群和4個(gè)亞群,但分子鑒定的劃分方式與依據(jù)形態(tài)特征區(qū)分的種、亞種或地理種的對(duì)應(yīng)關(guān)系尚待進(jìn)一步的研究。Senousy等人[2]分析了不同化學(xué)族藻株的18S rDNA序列,發(fā)現(xiàn)利用核苷酸序列區(qū)分的類群與化學(xué)分類方法具有一致性。因此,利用分子遺傳學(xué)方法鑒定藻株的基因型,可迅速了解其化學(xué)組成特性,提高了研究效率。

3.2 叢粒藻遺傳多樣性

核基因組中的18S rRNA、ITS區(qū)序列和葉綠體基因組中的rbcL基因、matK基因、trnL內(nèi)含子和trnLF基因間隔區(qū)、ndhF基因、atpB基因以及線粒體基因組中的cox I、atpA基因是目前植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的常用片段[21]。本文共分析了16株叢粒藻藻株的18S rDNA序列和ITS區(qū)序列,結(jié)果未見(jiàn)序列完全相同的藻株,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察顯示叢粒藻遺傳多樣性較高,也表明分布于世界不同地點(diǎn)的叢粒藻存在一定程度的地理隔離。

叢粒藻作為1種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的能源微藻,制約其應(yīng)用的最大的障礙在于其生長(zhǎng)速度很慢,但叢粒藻豐富的遺傳多樣性為分離篩選快速生長(zhǎng)藻株,或通過(guò)遺傳育種技術(shù)培育速生藻株提供了豐富的遺傳材料。

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