飼料中硒和α-硫辛酸對皺紋盤鮑稚鮑抗氧化反應(yīng)的影響*

陳齊勇,張文兵,麥康森,馬洪明,劉付志國

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

水生動(dòng)物由于生活環(huán)境較為復(fù)雜,體內(nèi)的活性氧(ROS)水平常因水中溶解氧、溫度以及毒素等環(huán)境因子的異常變化而升高,以至超過自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力,這時(shí)過量的ROS由于其高度活躍的化學(xué)性質(zhì)往往引起蛋白、脂肪、核酸等生物大分子氧化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1-2]。大量研究表明,多種疾病的發(fā)生都與體內(nèi)的ROS水平有著直接的關(guān)系[3]。因此,關(guān)注水生動(dòng)物的健康應(yīng)該對其體內(nèi)氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡引起重視。

硫辛酸的抗氧化功能在眾多的“離體”和“在體”試驗(yàn)中都已得到證實(shí)[3-5]。它不僅能夠清除氧自由基、螯合重金屬離子,還具有修復(fù)氧化損傷的作用[3]。然而,硫辛酸同時(shí)具有促氧化效應(yīng)[3],這主要取決于氧化應(yīng)激的形式和機(jī)體的生理狀態(tài)[6]。目前為止,對硫辛酸的抗氧化作用的研究主要集中于陸生脊椎動(dòng)物[7-10],在水生動(dòng)物中發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù)較少。

硒是動(dòng)物必需的微量元素,也是1種潛在的抗氧化劑,常作為谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心參與抗氧化作用[11]。Tirosh等[12]對H T4神經(jīng)細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn),硒和硫辛酸的協(xié)同作用能更為有效地保護(hù)細(xì)胞免受谷氨酸鹽的氧化損傷。萬敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)飼料中硒和維生素E的相互作用顯著影響皺紋盤鮑血清過氧化氫酶(CA T)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性。當(dāng)飼料中含有450 IU/kg的維生素E時(shí),添加0.6 mg/kg的硒能使皺紋盤鮑血清中的抗氧化物酶系統(tǒng)總體達(dá)到相對平衡,從而有效的抵抗氧化脅迫[13]。

在影響皺紋盤鮑抗氧化能力的營養(yǎng)因子方面,發(fā)表的數(shù)據(jù)主要集中在維生素上,如維生素D[14]、維生素A[15]、維生素E[16]、維生素E和硒的交互作用[13]。本研究的目的是探討飼料中硒和硫辛酸對皺紋盤鮑抗氧化反應(yīng)的影響,為從營養(yǎng)途徑提高皺紋盤鮑抗氧化脅迫的能力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼料配制

基礎(chǔ)飼料參照Mai等[17]的配方,以酪蛋白和明膠為蛋白源,鯡魚油和大豆油(1∶1)為脂肪源,糊精為主要糖源,輔以纖維素、維生素、礦物質(zhì)等配制而成。利用2×3的雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),分別添加硒(0,1 mg/kg)和硫辛酸(0,800,3 200 mg/kg)配制成6種半精制飼料。其中,硫辛酸(純度98%,DL-α-Lipoic acid)由Lancaster公司提供,硒源為Na2SO3·5H2O?；A(chǔ)飼料中常規(guī)指標(biāo)包括粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的測定參照AOAC[18]。

飼料制作參照Zhang等[19],稍作修改,原料經(jīng)粉碎過100目篩后,用電子天平按配方比例準(zhǔn)確稱取,將其充分混勻,輔以其質(zhì)量的80%左右的蒸餾水揉勻,搟薄(厚度約0.5 mm)切割成約1 cm2的薄片。片狀飼料要在5%(g/L)的氯化鈣溶液中浸泡約1 min,使褐藻酸鈉轉(zhuǎn)變成為穩(wěn)定不溶于水的褐藻酸鈣凝膠,以減少營養(yǎng)物質(zhì)的溶失。飼料風(fēng)干后密封于樣品袋中并保存在-20℃冰柜中待用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組和養(yǎng)殖管理

皺紋盤鮑稚鮑購自青島鰲山衛(wèi)育苗場,為當(dāng)年人工孵化的同一批鮑苗。經(jīng)暫養(yǎng)2周后挑選規(guī)格一致的健康個(gè)體(平均體質(zhì)量(0.43±0.00)g)隨機(jī)分成6組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)50只鮑魚。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及其營養(yǎng)成分Table 1 Ingredient and proximate composition of the basal diet

生長試驗(yàn)在中國海洋大學(xué)鰲山衛(wèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行,流水養(yǎng)殖16周。試驗(yàn)期間,每天17··00投喂,次日08··00清底,并密切觀察稚鮑采食及健康狀況。養(yǎng)殖過程中水溫15～25℃,鹽度22～28,p H=7.4～7.9,溶解氧不低于6 mg/L,水體中硒含量為1.54μg/L。

1.3 樣品的采集和處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí),停喂稚鮑3 d以排空其腸道內(nèi)容物。收集肝胰臟,將其剪成小塊混勻后分裝在小管中,所有樣品保存在-80℃冰箱中待測。肝胰臟樣品使用前解凍,加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.86%生理鹽水,質(zhì)量濃度=1/9),冰上勻漿,然后4℃、4 000 r/min離心15 min,取上清測定抗氧化指標(biāo)。

參考B radfo rd[20]的考馬斯亮蘭法測定肝胰臟勻漿液中蛋白質(zhì)的含量,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。過氧化氫酶(CA T)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定參照萬敏等[13]的方法;丙二醛(MDA)的測定參照Sahin等[21]的硫代巴比妥酸法;總抗氧化力(T-AOC)測定采用鐵離子還原/抗氧化力測定法(FRAP),參考Benzie和Strain[22];谷胱甘肽(GSH)用比色法測定,參照Anderson等[23]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0軟件和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用百分?jǐn)?shù)表示的數(shù)據(jù)先轉(zhuǎn)化成反正弦方根后再進(jìn)行方差分析。差異顯著時(shí)用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。顯著水平為0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 超氧化物歧化酶(SOD)

從表2可以看出,硫辛酸顯著影響了肝胰臟中SOD活力(P<0.05),硒及硒與硫辛酸的交互作用對SOD都無顯著影響(P>0.05)。SOD活力在添加800 m g/kg硫辛酸的兩處理組顯著高于0 m g/kg添加組(P<0.05),3 200 mg/kg硫辛酸處理組與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.2 谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)

硫辛酸和硒對皺紋盤鮑肝胰臟中GPX活性均有顯著影響(P<0.05)(見表2),但無顯著交互作用(P>0.05)。當(dāng)飼料中不添加硫辛酸時(shí),硒顯著提高了GPX活性;在添加800和3 200 mg/kg硫辛酸后,硒添加組GPX活力比不添加組有所增加,但差異不顯著(P>0.05)。飼料中添加800 mg/kg硫辛酸顯著提高了GPX活性,3 200 m g/kg硫辛酸則降低了其活性(P<0.05)。

表2 飼料中添加α-硫辛酸(LA)和硒(Se)對皺紋盤鮑稚鮑肝胰臟中抗氧化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Table 2 Effects of diet supplementedα-lipoic acid(LA)and selenium(Se)on anti-oxidative parameters in hepatopancreas of juvenile abalone,Haliotis discus hannai Ino(mean±S.E.,n=3)

2.3 谷胱甘肽(GSH)

如表2所示,硫辛酸顯著影響肝胰臟中GSH含量,硒對GSH影響不顯著且和硫辛酸無顯著交互作用。但在添加硫辛酸后,1 mg/kg硒添加組的GSH水平相比缺乏組表現(xiàn)出增加的趨勢。在添加和不添加硒的情況下,GSH水平都隨硫辛酸添加量的增加而增加,其中在同時(shí)添加1 mg/kg硒和3 200 mg/kg硫辛酸的處理組GSH最高,并顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 過氧化氫酶(CA T)

不同處理的稚鮑的CA T在1.29～1.78之間(見表2),硒和硫辛酸對CA T都無顯著影響,亦無顯著交互作用(P>0.05)。

2.5 丙二醛含量(MDA)

皺紋盤鮑稚鮑的MDA值在3.59～4.18之間變化(見表2),各處理組間無顯著差異(P>0.05)。但添加硒和800 m g/kg硫辛酸時(shí)MDA值低于對照組,而添加3 200 mg/kg硫辛酸表現(xiàn)出升高的趨勢。

2.6 總抗氧化力(T-AOC)

T-AOC值的變化如表2所示,硒和硫辛酸分別顯著影響了稚鮑肝胰臟T-AOC值(P<0.05),但兩者無交互作用(P>0.05)。在飼料中添加0和3 200 mg·kg-1的硫辛酸時(shí),1 mg/kg的硒顯著增加了T-AOC值(P<0.05),而添加800 m g/kg硫辛酸時(shí),硒對T-AOC值影響不顯著(P>0.05)。無論添加或不添加硒,在800 mg/kg處理組T-AOC升高,在3 200 mg/kg組降低,最低值出現(xiàn)在不添加硒同時(shí)添加3 200 mg/kg硫辛酸的處理組,顯著低于對照組(P<0.05)。

3 討論

SOD、GPX和CA T都是抗氧化系統(tǒng)中主要的抗氧化酶,SOD催化超氧自由基的歧化反應(yīng),在維持生物體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能中起著重要作用;GPX幫助阻止氫過氧化物和有機(jī)過氧化物的形成,該酶活性降低,則引起自由基和過氧化物積累,進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)和細(xì)胞膜氧化損傷[24];CA T是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶,催化過氧化氫降解。這幾種抗氧化酶常被用于衡量機(jī)體的抗氧化狀態(tài)。T-AOC是用于評價(jià)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)性能的綜合性指標(biāo)[25]。

在本研究中,飼料中添加800 mg/kg硫辛酸時(shí),皺紋盤鮑稚鮑肝胰臟中SOD和GPX活力顯著提高,硫辛酸表現(xiàn)出抗氧化作用,與Kow luru和Odenbach[26]在小鼠上的研究結(jié)果一致;而添加3 200 mg/kg硫辛酸時(shí)SOD和GPX活力下降,與不添加硫辛酸的對照組的值之間沒有顯著差異。皺紋盤鮑肝胰臟中TAOC的變化趨勢也與SOD和GPX這2種酶相似,并且在硫辛酸添加量為3 200 mg/kg時(shí)T-AOC的值顯著低于對照組和800 mg/kg添加組。另外,盡管肝胰臟中MDA的含量沒有受到飼料中硫辛酸添加量的顯著影響,但是存在飼料中添加3 200 mg/kg硫辛酸有提高M(jìn)DA含量的趨勢。因此,從SOD、GPX、T-AOC和MDA隨飼料中硫辛酸不同添加量的變化情況來看,800 mg/kg是飼料中硫辛酸的適宜添加量,當(dāng)添加量達(dá)到3 200 mg/kg時(shí),有降低體內(nèi)抗氧化能力而提高氧化脅迫的趨勢。在其它的一些研究中也發(fā)現(xiàn)硫辛酸具有促氧化作用[3],這主要取決于氧化應(yīng)激的形式和機(jī)體的生理狀態(tài)。飼料中過量添加硫辛酸對皺紋盤鮑機(jī)體造成潛在的氧化脅迫的機(jī)理值得開展進(jìn)一步的研究。

GSH是體內(nèi)GPX分解過氧化物必需的底物,被認(rèn)為是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[27]。在本研究中,GSH隨著硫辛酸添加量的增加而升高,這與GPX、SOD和T-AOC的變化趨勢不同。GSH的持續(xù)升高可能與硫辛酸促進(jìn)了用于合成GSH的半胱氨酸的運(yùn)輸有關(guān)[28],或是因?yàn)榱蛐了嵩黾恿薌SH合成酶的活性[10]。由此可見,如何正確使用體內(nèi)GSH的變化情況來評價(jià)硫辛酸影響下機(jī)體的抗氧化能力,需要進(jìn)一步的商榷。

硒作為GPX的活性中心,是GPX發(fā)揮抗氧化作用的重要部分。值得一提的是本研究結(jié)果顯示在飼料中不添加硫辛酸時(shí),硒顯著提高了肝胰臟中GPX活性,這與萬敏等[13]對皺紋盤鮑的研究結(jié)果一致。但當(dāng)飼料中添加800和3 200 mg/kg硫辛酸時(shí),硒對GPX沒有顯著影響,說明硒對皺紋盤鮑GPX的作用是有條件的,本試驗(yàn)中受到硫辛酸的影響。另外,本研究中當(dāng)飼料中不添加硫辛酸或硫辛酸添加過量(3 200 mg/kg)時(shí),硒顯著提高肝胰臟中T-AOC的值。而在添加適量硫辛酸(800 mg/kg)時(shí),硒對T-AOC的影響不顯著,說明硫辛酸也影響了硒對T-AOC的作用。反之,硒也影響了硫辛酸對T-AOC的作用,當(dāng)飼料中沒有添加硒時(shí),硫辛酸(800 mg/kg)顯著提高了肝胰臟中TAOC水平,但當(dāng)飼料中添加硒后,硫辛酸(800 mg/kg)對肝胰臟中T-AOC水平影響不顯著。由此可見,盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性,飼料中硫辛酸和硒之間對皺紋盤鮑機(jī)體抗氧化狀態(tài)的影響有潛在的交互作用。為了更好的揭示這種交互作用,在今后的研究中應(yīng)該增加飼料中硒和硫辛酸的添加梯度。

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