高生存性乳酸菌的篩選

朱宏，陸淳，馮麗莉，盧曉麗，王世杰

(石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221)

高生存性乳酸菌的篩選

朱宏，陸淳，馮麗莉，盧曉麗，王世杰

(石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221)

對(duì)MRS培養(yǎng)基進(jìn)行了厭氧培養(yǎng)，從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離了80株菌，通過(guò)鏡檢、過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵核糖、15℃和37℃發(fā)酵試驗(yàn)，獲得了43株乳桿菌。結(jié)果表明，14株菌具有一定的耐酸和耐膽鹽特性；其中2株鑒定為副干酪乳桿菌和植物乳桿菌，分別命名為L(zhǎng)actobacillus paracaseiN1115和Lactobacillus plantarumN3114。

乳酸菌；高生存性；耐酸；耐膽鹽；篩選

0 引言

乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等益生作用[1-3]。然而，人體胃腸道中的胃酸、膽汁等物質(zhì)，構(gòu)成了一道天然屏障，使乳酸菌在通過(guò)消化道時(shí)會(huì)被胃酸及腸道消化液所殺死。因此，篩選能夠活著進(jìn)入腸道、具有高生存性的乳酸菌，是益生菌開(kāi)發(fā)首要考慮的問(wèn)題。

內(nèi)蒙古作為我國(guó)的傳統(tǒng)牧區(qū)，酸奶和奶酪是當(dāng)?shù)啬撩竦闹饕澄飦?lái)源。傳統(tǒng)的奶制品加工方法經(jīng)過(guò)數(shù)百年的優(yōu)化，篩選，較好地保存了當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益乳酸菌，是天然的乳酸菌貯存庫(kù)[4]。本研究中，研究人員從內(nèi)蒙古四子王旗等地農(nóng)戶家中采集的酸奶樣品中成功地分離了80株乳酸菌，獲得了具有耐酸和耐膽鹽的高生存性乳酸菌，并對(duì)這些分離的乳酸的耐酸以及耐膽鹽特性進(jìn)行了詳細(xì)的分析。報(bào)道如下。

1 材料

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品。培養(yǎng)基為MRSA實(shí)驗(yàn)室自制，API CHL培養(yǎng)基和API 50 CH試劑條，糖發(fā)酵管，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%脫脂乳，pH值為2.0磷酸緩沖液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3‰豬膽鹽溶液，儀器：厭氧罐，顯微鏡，生化培養(yǎng)箱（SPX-250BS-Ⅱ），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）。

2 實(shí)驗(yàn)原理和方法

（1）菌株分離純化。菌株分離要使欲分離樣品中的乳酸菌盡可能多的暴露于培養(yǎng)基上，形成肉眼可見(jiàn)的菌落。首先，將實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-3，10-4，10-53種稀釋度，涂布于MRSA平板上，37℃厭氧培養(yǎng)72 h后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌的菌落特征以及參考相關(guān)文獻(xiàn)圖片，挑選可疑菌落。然后在有氧環(huán)境培養(yǎng)，連續(xù)傳代不少于3次，獲得純化的菌落。

（2）菌種初篩。在乳酸菌中，乳桿菌通常具有比球菌更好的耐酸耐膽鹽能力，在消化道中的生存能力更強(qiáng)，因此，該步驟的目的是初步獲得乳桿菌。根據(jù)文獻(xiàn)以及標(biāo)準(zhǔn)菌株的實(shí)驗(yàn)，乳桿菌在MRSA上的菌落為白色、不透明、直徑為2～3 mm；革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫陰性，無(wú)芽胞，沒(méi)有運(yùn)動(dòng)性，糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸，可以發(fā)酵五碳糖（核糖），可以在溫度為15℃和37℃條件下生長(zhǎng)。因此，通過(guò)設(shè)定以上指標(biāo)可初步確定為乳酸桿菌。

（3）菌種復(fù)篩。作為具有益生特性的乳酸菌，其生存性首先是對(duì)人體胃腸道屏蔽的耐受性，因此，菌種復(fù)篩主要是對(duì)所獲得的乳桿菌進(jìn)行耐酸耐膽鹽的檢測(cè)。挑取1接種環(huán)菌株接種到MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)37℃（48 h），取出計(jì)數(shù)；同時(shí)，各取1 mL該發(fā)酵液，分別加入至pH值為2.0的磷酸鹽緩沖液中（孵育37℃，2 h），和3‰的豬膽鹽溶液（孵育37℃，6 h），取出后，立即進(jìn)行梯度稀釋（0.85%滅菌生理鹽水），進(jìn)行菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算其存活率。

（4）菌株鑒定。對(duì)所獲得的具有耐酸耐膽鹽的菌株，根據(jù)不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性進(jìn)行分類(lèi)，確定雷同菌株，然后對(duì)同一類(lèi)中具有更好特性的菌株應(yīng)用API50進(jìn)行菌種鑒定。

3 結(jié)果

3.1 菌種的初篩

從傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品接種厭氧培養(yǎng)的MRSA培養(yǎng)基上，共挑取白色、光滑的菌落80個(gè)；經(jīng)連續(xù)3代培養(yǎng)，共獲得可以在有氧環(huán)境培養(yǎng)的菌株53株，其中球菌為17株，桿菌36株。經(jīng)革蘭氏染色、過(guò)氧化氫、核糖發(fā)酵試驗(yàn)，最終獲得過(guò)氧化氫陰性、可以發(fā)酵核糖、不產(chǎn)氣的革蘭氏陽(yáng)性桿菌為29株。此29株菌可初步斷定為有可能在發(fā)酵乳中使用的乳酸桿菌。

3.2 菌種的復(fù)篩

對(duì)初篩獲得的29株乳酸桿菌進(jìn)行耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)，其中耐酸菌株17株，耐膽鹽菌株21株，能夠同時(shí)耐酸耐膽鹽菌株為14株。

不同的菌株對(duì)酸和膽鹽的耐受性存在很大的差異。有些菌株只能耐酸，不能耐膽鹽，如N4110，在酸液處理后的存活比例為0.06‰，但是在膽鹽處理后的存活率卻小于0.01‰；有些菌株只耐膽鹽，不能耐受酸，如N3207，在膽鹽溶液處理后的存活率為0.04‰，但是在酸液處理后的存活率卻小于0.01‰；有些菌株既能耐酸又能耐膽鹽，如N1115、N3114、N4111是所篩選菌株中具有較高耐酸和耐膽鹽水平的菌株，尤其在酸液處理后的存活率能達(dá)到120‰，在膽鹽溶液處理后的存活率也能達(dá)到10‰（如表1所示）。

表1 部分菌株對(duì)酸和膽鹽的耐受性比較

3.3 菌株的初步鑒定

本研究對(duì)部分具有較高耐酸耐膽鹽的菌株進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果如表2所示。菌株的部分特性鑒定結(jié)果如表3所示。通過(guò)API50鑒定系統(tǒng)檢測(cè)，N1115為干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），N3114為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；將其命名為L(zhǎng)actobacillus paracaseiN1115和Lactobacillus plantarumN3114；并將其列入石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司菌種保存中心JMCC（Junlebao Microbiology Collection Center）編號(hào)為JMCC0001和JMCC0002。

表2 N1115與N3114兩菌株API50鑒定結(jié)果

表3 鑒定菌株的部分特性

4 結(jié)果與討論

分離高生存性乳酸菌的關(guān)鍵步驟在于，乳酸桿菌的初步分離。本研究中樣品取自內(nèi)蒙古牧民自制的發(fā)酵乳制品，內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品是乳酸菌天然的寶庫(kù)，其中已報(bào)道[5，6]分離到的乳酸菌有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、明串珠菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等。但是，這種作為從野外收集的原始樣品中微生物資源豐富，不僅有豐富的乳酸菌，而且會(huì)會(huì)存在很多的雜菌，例如霉菌、酵母、耐熱芽孢桿菌、嗜冷菌等。采用厭氧培養(yǎng)作為分離的第一步，使很多的雜菌不能生長(zhǎng)，大大縮減了工作量；同時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌的菌落特征以及參考相關(guān)文獻(xiàn)圖片，挑選可疑菌落，具有較強(qiáng)的針對(duì)性，然而由于初次分離經(jīng)驗(yàn)不足，所挑取的80株菌中，能夠滿足過(guò)氧化氫陰性、可以發(fā)酵核糖、不產(chǎn)氣、兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性乳酸桿菌為29株。由于野生菌株不穩(wěn)定性，很多菌株在連續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程中就逐步弱化，而不能生長(zhǎng)。

本研究從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離得到具有耐酸、耐膽鹽的高生存性的2株乳桿酸菌并通過(guò)API50鑒定系統(tǒng)檢測(cè)為L(zhǎng)actobacillus paracaseiN1115和Lactobacillus plantarumN3114。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）廣泛存在于傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品和人體胃腸道中[7]，目前的研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌可增強(qiáng)宿主對(duì)微生物病原體的非特異性抵抗力，加快腸道內(nèi)病原體的清除；能夠治療腸道菌群紊亂和腸道通透性增強(qiáng)，從而防止食物過(guò)敏和急性腹瀉；使抗低密度氧化脂抗體和CD4T-淋巴細(xì)胞增加，粒細(xì)胞的噬菌作用明顯增強(qiáng)，對(duì)宿主進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，防止腫瘤的產(chǎn)生等作用[8-10]。其作為益生菌調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫功能、預(yù)防疾病等方面有著廣闊的發(fā)展前景。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）也是人體胃腸道的益生菌群，代謝可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，降低膽固醇水平，緩解乳糖不耐癥及抑制腫瘤細(xì)胞的形成等作用[11]。

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是我國(guó)衛(wèi)生部公布的《可用于生產(chǎn)普通食品的菌種名單》中的菌種，因此，本研究所獲得Lactobacillus paracaseiN1115和Lactobacillus plantarumN3114具有作為益生菌的良好潛質(zhì)。

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Screening of lactic acid bacteria strains with high survivability

ZHU Hong，LU Chun，F(xiàn)ENG Li-li，LU Xiao-li，WANG Shi-jie
(Shijiazhuang Junlebao Dairy Co.Ltd.,Shijiazhuang 050221,China)

There were 80 strains of bacterias isolated from traditional fermented milk in Inner Mongolia of China with anaerobic cultured in MRSA.Among 80 strains,43 strains ofLactobacilliwere proved with G+,H2O2test with positive,using ribose,growing at 15℃and 37℃.And 43 strains ofLactobacilliwere assessed for for their survivability,14 strains turned out to be acid resistance and bile salt tolerance.LAB spcies of 2 strains were identified and namedLactobacillus paracaseN1115 andLactobacillus plantarum.

Lactic acid bacteria；high survivability；acid resistance；bile salt tolerance；screening

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）04-0020-03

2011-01-17

朱宏（1964-），男，博士，高級(jí)工程師，從事乳品科學(xué)研究。