耐熱型復合乳酸菌凍干保護劑的研究

孫盈，黃金海，李瑩，賈程坤，高嵽，劉陽，魯珂成

（天津大學化工學院，天津 300072）

耐熱型復合乳酸菌凍干保護劑的研究

孫盈，黃金海，李瑩，賈程坤，高嵽，劉陽，魯珂成

（天津大學化工學院，天津 300072）

為獲得對于混合乳酸桿菌最佳的耐熱凍干保護劑配方，考察了不同凍干劑單因子添加物及5種凍干保護劑配方對冷凍干燥后乳酸菌的存活率、耐熱性能，失水情況和感官指標，利用中心組合響應曲面法設計，獲得以活菌率，耐熱性和失水率為控制指標的保護劑組分優(yōu)化的多元二次方程，并進行顯著性分析。結果表明，通過初步篩選獲得感官良好、復溶后相容性好的凍干介質，進一步條件優(yōu)化得到最佳配方。最佳凍干保護劑配方為脫脂乳10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5%，海藻糖5%，維生素C為0.5%（均為質量分數），此時凍干后活菌率的預測值可達到93.05%，37℃保存10 d后活菌率預測值可達到77.26%，具有較好的耐熱性能。

乳酸菌；凍干保護劑；中心組合設計；耐熱性

0 引言

近年來，隨著人們消費水平的提高和健康理念的改善，發(fā)酵乳制品的關注度不斷得到提升，直投式酸奶發(fā)酵劑因其活力強、含菌量高、菌量穩(wěn)定，保存期長、耐儲運，使用方便，發(fā)酵產品穩(wěn)定等優(yōu)點而成為了研發(fā)熱點[1]。作為提升發(fā)酵劑活力的關鍵工藝，凍干保護劑能有效防止細菌細胞死亡，保證活菌量和延長菌種保藏期。我國酸乳市場廣闊，研制滿足規(guī)?；白灾扑崛榈榷嘣袌鲂枨螅m應不同冷鏈流通的耐熱凍干保護劑酸乳菌種具有重要意義[2，3]。本文通過活菌計數，耐熱性，凍干劑外觀及相容性評價等指標的分析，對復合凍干保護劑配方進行篩選研究，以期為發(fā)酵劑的工業(yè)化生產提供依據[4，5]。

1 實驗

1.1 材料

保加利亞乳酸桿菌A株，嗜熱鏈球菌S株，嗜酸乳桿菌CL10株，鼠李糖乳酸桿菌L3株，均由本實驗室分離保存。

質量分數為20%脫脂乳，MRS液體培養(yǎng)基，HHD固體培養(yǎng)基，滅菌0.5%NaCl溶液，按文獻配制；蔗糖，海藻糖，明膠，谷氨酸鈉，維生素C，聚乙二醇（PEG6000），聚乙烯吡咯烷酮（PVP30），山梨醇均為生物純或化學純。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)

將37℃過夜培養(yǎng)的乳桿菌、嗜熱鏈球菌、CL10及L3菌培養(yǎng)物，以終濃度2%分別接種含1%脫脂乳MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后分別取樣進行活菌計數。其余培養(yǎng)菌分別以5 000 r/min離心10 min，菌泥稱重后加入適量MRS懸浮，再按一定體積比混合制備復合乳酸菌劑。

1.2.2 復合乳酸菌保護劑效果的檢測

設置不同的凍干劑組方，將上述菌液與不同凍干劑等體積混合，混勻后分裝于青霉素瓶中，每瓶2 mL,每組5個重復。各組樣品置-40℃的冰箱中預冷4 h，然后于預冷的冷凍干燥機中冷凍干燥16～18 h。凍干過程中觀察不同凍干劑組水分升華快慢情況，待全部樣品冷凍干燥充分后，取出樣品，進行失水率及活菌計數等指標的測定：

（1）凍干后失水率Y3=（凍干前菌質量-凍干后菌質量）/凍干前菌質量×100%；

（2）凍干后活菌率Y1=凍干后菌數/凍干前活菌數×100%；

（3）各組樣品置37℃溫箱放置10 d后進行活菌計數，計算耐熱處理后的活菌率Y2，Y2=37℃，10 d后活菌數/凍干前活菌數×100%；

（4）凍干菌粉外觀感官指標評價分級如表1所示。

微寫作不同于傳統(tǒng)作文。它沒有篇幅、體裁和格式的具體限定；它相對于傳統(tǒng)作文來說是一種作文的升華，避免了傳統(tǒng)寫作中為考試而寫作的弊端，使得作文變得更加生動靈活，且融入學生更多有趣的靈魂和真實情感。它的重點都集中在一個“微”字上，既可以是外在的微，也可以是內容上的微；它既沒有傳統(tǒng)記敘文對時間、地點、人物、事件的限定，也沒有議論文對論點、論據的規(guī)定，更沒有小說對人物、情節(jié)、環(huán)境的要求；它切實將學生視為微寫作的主體，讓學生更愿意主動表達自己的情感和觀點。

表1 凍干菌粉感官評分標準

凍干菌粉感官評價總分為30分：得分24分以上為優(yōu)質凍干菌粉，27分以上為特優(yōu)，20分以上到24分為良好凍干乳粉，16分以上至20分為合格凍干乳粉，16分及以下為劣質凍干乳粉。

1.2.3 耐熱凍干保護劑篩選

（1）在以質量分數為3%脫脂乳MRS的基礎上，分別選擇加入7%的PEG6000，7%的PVP30，2%～4%甘油，10%淀粉，7%谷氨酸鈉作單因素凍干劑實驗，使總菌量達3×1013mL-1，冷凍干燥后，感官指標評價選擇外觀，復溶性快速、均勻的原料做進一步研究。

（2）幾種復合保護劑的相容性比較。保護劑配方：保護劑A（10%脫脂乳和8%蔗糖，均為質量分數），保護劑B（8%脫脂乳、2.4%明膠、2%海藻糖、5%蔗糖，均為質量分數），保護劑C（10%脫脂乳，5%海藻糖，1%谷氨酸鈉，2%維生素C，均為質量分數），保護劑D（8%脫脂乳，7%聚乙烯吡咯烷酮，2%海藻糖，5%蔗糖，0.2%山梨醇，均為質量分數），保護劑E（10%脫脂乳，5%葡萄糖，1%谷氨酸鈉，2%維生素C，均為質量分數）。

（3）幾種添加物對耐熱凍干保護劑的影響。參考前期5種復合保護劑的綜合評價情況，選擇脫脂乳、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、維生素C（Vc）4個因素、3個水平，其他固定添加因子分別為4%蔗糖、1%葡萄糖和1%谷氨酸鈉，利用軟件Design-Expert 8.0.4，選擇響應面分析法(Response Surface)的中心組合設計(Central Composite Design)進行方案設計和試驗實施。

中心組合方式(Face Centered)α=1.0?；貧w模型為二次方程形式。通過凍干后活菌率Y1,37℃放置10 d后活菌率Y2，凍干后失水率Y33個指標的比較，評價耐熱凍干保護劑的效果。選擇以獲得凍干后活菌率Y1，耐熱處理Y2為主要評價指標，在等權重系數時，根據Design Expert軟件最優(yōu)解計算法，獲得修正后的最佳耐熱凍干保護劑理想組方。

2 結果

2.1 不同乳酸菌的培養(yǎng)

將培養(yǎng)的保加利亞乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳酸桿菌分別離心，菌泥稱重，MRS懸浮后，按適當的活菌比，配制成總菌量為12×1013mL-1備用。

2.2 不同單因素添加物對凍干外觀的影響

單因素試驗中，添加7%PEG6000，PVP30，甘油后的實驗組，凍干過程明顯延長，而且凍干后樣品聚縮在一起，難溶性增加；添加淀粉的凍干樣品，均一性，色澤較佳。

2.3 5組復合保護劑的結果比較

不同保護劑凍干菌的失水率如圖1所示。

由圖1可以得出，凍干菌粉失水率比較B＞A＞C＞E＞D。冷凍過程中觀察凍存瓶的水分升華線得到干燥速度的順序為E＞D＞A≈C＞B。

凍干菌粉感官指標如表2所示。由表2可以看出，凍干菌粉外觀綜合比較為A＞B＞D＞E＞C。

表2 凍干菌粉感官指標評分

活菌記數結果如表3所示。由表3可以看出，凍干后菌種活率比較E＞C＞B＞A＞D；37℃保存10 d后菌種活率比較為D＞C＞A＞B＞E。

表3 凍干及耐熱處理后活菌記數結果

表4 中心組合實驗設計及結果%

2.4 不同添加物對耐熱凍干保護效果的影響

實驗設計結果如表4所示。

利用Design Expert軟件對凍干保護劑響應曲面設計試驗的實測值與預測值進行二次多項回歸擬合，獲得凍干后活菌率（Y1）、37℃10 d后活菌率(Y2)以及失水率(Y3)的預測值對自變量脫脂乳(A)、海藻糖(B)、PVP(C)和Vc(D)的多元回歸方程分別為

由表5可以看出，除凍干后活菌率指標方程差異顯著外，37℃（10 d）后活菌率和失水率指標方程差異均為極顯著，說明3個指標與所選因素之間存在顯著的回歸關系。PVP的加入，對乳酸菌凍干過程的成活率，耐熱性及凍干的失水率都有顯著影響。在耐熱性方面，不同添加物之間有較顯著的影響，適量Vc的加入有助于改善乳酸菌保護劑的耐熱性能。

以獲得凍干前后活菌率、37℃處理10 d后耐熱性為主要指標，等權重條件下獲得了修正后的最佳耐熱凍干保護劑組方：脫脂乳10%，PVP5%，海藻糖5%，維生素C 0.5%（均為質量分數），此時凍干后活菌率的預測值可達到93.05%，37℃保存10 d后活菌率預測值可達到77.26%。

3 討論

發(fā)酵酸乳市場需求大，優(yōu)良及高活菌率的直投式乳酸菌菌種的研究成為熱點。食品耐熱凍干保護劑的研究，除具有良好的外觀、凍干組分安全無毒，加水后復溶性好等優(yōu)點外，保持凍干后高活菌率及活菌維持時間，即具有良好的耐熱性能，才能滿足理想凍干保護劑的要求。本研究所選用了作用機制不同的凍干保護劑組分，從凍干后外觀，復溶能力，凍干菌粉的持水性能，凍干后活菌率，凍干菌耐熱性能等方面探討凍干劑組分的相互作用，并篩選優(yōu)化復合乳酸菌凍干組方。

研究中選用了天然及合成的高分子物質，脫脂乳、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等，它們在凍干生物制品中主要起骨架作用，使凍干制品形成多孔性、疏松的海綿狀物，從而使溶解度增加[8]；大分子明膠、聚乙烯吡咯烷酮具有很強的親水特性和氫鍵形成能力，利用其氫鍵和親水基形成一個穩(wěn)定的水分子層，阻礙膜內結合水向外轉移，保護了細胞的結構[5]，谷氨酸鈉和高蛋白含量可顯著提升凍干過程細菌的存活率。小分子糖、醇的加入可提高干燥升華速度[7]，縮短凍干時間。但研究中發(fā)現過高濃度的小分子糖醇又會導致凍干制品表面起泡、不平整；過高濃度的PVP、PEG等高分子物質，可顯著地延緩干燥過程，凍干制品的終含水量也較高。研究也表明，添加海藻糖可顯著提高凍干菌的耐熱性能，延長保存期。Hubel[9]和Zayed[10]分別從“玻璃體學說”和“水替代假說”角度表明海藻糖分子能減少保存以及復水過程中細菌細胞的死亡，具有明顯的增強耐熱的功能。

表5 實驗結果的方差分析

4 結束語

在保證外觀及良好復水性能的基礎上，進一步通過不同添加物的正交優(yōu)化實驗，利用中心組合響應曲面分析，通過凍干后活菌率、37℃（10 d）保存后的活菌率的評價，可獲得最佳的凍干保護劑配方為脫脂乳10%，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5%，海藻糖5%，維生素C為0.5%，此時凍干后活菌率的預測值可達到93.05%，37℃保存10 d后活菌率達77.26%。

[1]呂燕妮,靳志強,李平蘭，等.酸奶生產用直投式乳酸菌發(fā)酵劑研究[J].中國乳業(yè),2005,(11):47-50.

[2]姜鐵民,隋欣,王建，等.直投式發(fā)酵劑制備中乳酸菌增殖條件的探討[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(8):112-114.

[3]趙晉,王嬌.直投式酸奶發(fā)酵劑的應用與研究現狀[J].乳品加工, 2006,11:54-56.

[4]呂加平,駱承癢.乳酸菌發(fā)酵劑凍干保護劑篩選及應用的研究[J].東北農業(yè)大學學報,1998,29(4):371-379.

[5]BAATI L,GEA C F,AURIOL D et al.Study of the Cryotolerance of Lactobacillus Acidophilus:Effect of Culture and Freezing Conditions on the Viability and Cellular Protein Levels[J].International Journal of Food Microbiology,2000,(59):241-247.

[6]HUBALEK Z.Protectants Used in the Cryopreservation of Microorganisms[J].Cryobiology.2003,(46):205-229.

[7]SANTIVARANGKNA C,HIGL B,FOREST P.Protection Mechanisms of Sugars during Different Stages of Preparation Process of Dried Lactic Acid Starter Cultures[J].Food Microbiology,2008,(25):429-441.

[8]VASILJEVIC T,JELEN P.Drying and Storage of Crude-galactosidase Extracts from Lactobacillus Delbrueckii ssp.Bulgaricus 11842[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2003,(4):319-329.

[9]HUBEL A,DARR T B,CHANG A，et al.Cell Partitioning during the Directional Solidification of Trehalose Solutions[J].Cryobiology, 2007,(55):182-188.

[10]ZAYED G,ROOS Y H.Influence of Trehalose and Moisture Content on Survival of Lactobacillus Salivarius Subjected to Freeze-drying and Storage[J].Process Biochemistry,2004,(39):1081-1086.

Study on freeze-drying protectant formula with heat-tolerance of complexLactic acid bacteria

SUN Ying,HUANG Jin-hai,LI Ying，JIA Cheng-kun,GAO Die,LIU Yang,LU Ke-cheng
(School of Chemical Engineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China)

Aim:Effect of different additions was to be analysed and optimal freeze-drying protectant formula with heat-tolerance of comolexLactic Acid Bacteriastrains(LABs)was to be obtained.Method:Detection of bacterial livability,heat-tolerance,driage and oranoleptic indicator among five freeze-drying protectant formulas and different additives was performed.Then the central composite response surface was employed to obtain the multiple quadratic equations on bacterial livability,heat-tolerance and driage and significant analysis.Result:The protectant medium with good organoleptic property and redissolved compatibility was screened preliminarily.Furthermore,the optimal formula was obtained.Conclusion:The optimal cryoprotectant with 93.05%predicted livability and high heat-tolerance was obtained with 10%skimmed milk,5%polyvinylpyrrolidone(PVP),5%trehalose,and 0.5%Vitamin C.

lactic acid bacteria,freeze-drying protectant,central composite，heat-tolerance

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）04-0012-04

2011-01-14

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目（08JCZDJC22600）。

孫盈(1988-)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

黃金海