漆酶在Fe3O4/SiO2表面的固定化及其性質(zhì)研究

徐璐璐，魏冬雪，王紅霞

(哈爾濱師范大學)

漆酶在Fe3O4/SiO2表面的固定化及其性質(zhì)研究

徐璐璐，魏冬雪，王紅霞

(哈爾濱師范大學)

采用共價－偶聯(lián)法，在較溫和的條件下進行漆酶在Fe3O4/SiO2載體上的固定化研究，利用TEM、FTIR、UV－vis和VSM等手段對固定化漆酶進行表征并考察其酶學性質(zhì).結(jié)果表明，漆酶在Fe3O4/SiO2載體上固載之后，其最適pH和溫度變化不大，但操作穩(wěn)定性和分離性能都有明顯改善，以ABTS為底物，固定化漆酶在重復使用10次后，酶活仍能保持在初始酶活的85%以上，反應之后的漆酶可以通過外加磁場快速分離.

漆酶;固定化;Fe3O4/SiO2

0 引言

漆酶是一類含銅的氧化還原酶，其對酚類及芳香類化合物的優(yōu)良降解能力引起了人們的廣泛關(guān)注［1－7］，尤其是當有可起氧化還原作用的介體存在時［8－10］，漆酶可氧化的底物范圍進一步擴大，偶氮類和靛青類等非漆酶底物染料此時也可以得到有效降解，這一特點使漆酶在工業(yè)染料降解方面顯示了重要的應用價值.

然而，由于游離漆酶難于回收，漆酶的固定化成為研究熱點.磁性材料作為漆酶的一種固定化載體［11－12，15］，對實現(xiàn)漆酶的快速分離和保持較高的操作穩(wěn)定性十分有利［13－17］.Huang 等［13］利用磁性殼聚糖固定化漆酶，固定化的漆酶具有磁可分性能，將其用于氧化底物ABTS，在循環(huán)使用10次以后漆酶的酶活仍然維持在初始酶活的80%以上;Salis等［14］利用磁性的SBA－15固定化漆酶，循環(huán)氧化原兒茶酸，使用14次以后原兒茶酸的轉(zhuǎn)化率仍能達到60%;Zhu等［15］利用磁性的中孔SiO2微球固定化漆酶，在氧化底物ABTS的循環(huán)試驗中，發(fā)現(xiàn)循環(huán)使用10次以后的酶活仍能維持在初始酶活的70%以上;Liu等［16］利用磁性的SiO2粒子固定化漆酶，并進行氧化鄰苯二酚的試驗，發(fā)現(xiàn)在循環(huán)使用10次以后固定化漆酶的酶活仍然保持在初始酶活的50%.在這些研究中，漆酶的固定化基本都是以戊二醛為交聯(lián)劑實現(xiàn)的，利用戊二醛上的醛基分別與漆酶和磁性載體表面的氨基鍵合，因此磁性載體表面的氨基修飾非常重要.在已有文獻［14－16，18］的報道中，載體表面的氨基修飾多是在甲苯或甘油為溶劑、60～120℃的回流條件下完成.本文探索在室溫、乙醇/水為溶劑的較溫和條件下進行Fe3O4/SiO2載體表面的氨基修飾和以戊二醛為交聯(lián)劑的漆酶固定化，隨后考察固定化漆酶的酶學性質(zhì)，結(jié)果表明漆酶固載成功，并且具有很好的操作穩(wěn)定性和磁分離性能.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，正硅酸乙酯(TEOS)，異丙醇，2，2'－連氮－雙(3－乙基并噻 －6－磺酸)(ABTS，Sigma)，漆酶(Sigma－Aldrich)，3－氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，戊二醛(天津市科密歐化學試劑中心).

1.2 固定化漆酶的制備

磁性Fe3O4/SiO2載體的制備參見文獻［19］.取100 mg Fe3O4/SiO2分散于50 mL 乙醇中，超聲分散，再加入5 mL去離子水和0.2 mL APS，在室溫下攪拌12 h，反應結(jié)束后水洗、磁分，得到氨基修飾的Fe3O4/SiO2載體(標記為Fe3O4/SiO2－NH2).向Fe3O4/SiO2－NH2中加入適量的戊二醛，在室溫下緩慢攪拌3 h，水洗、磁分，標記為Fe3O4/SiO2－NH2－GA，保存于磷酸緩沖液中備用;取適量漆酶溶解在pH=7的磷酸緩沖液中，并加入 Fe3O4/SiO2－NH2－GA，室溫下攪拌12 h，漆酶固定化完成，多次水洗、磁分，直至上清液中檢測不到蛋白質(zhì)為止，固定化漆酶標記為E－Fe3O4/SiO2－NH2－GA，在緩沖液中4℃保存?zhèn)溆?

1.3 固定化漆酶的表征及酶學性質(zhì)考察

采用日立H－7650型透射電子顯微鏡(加速電壓100kV)觀察漆酶固定化前后載體的形貌和尺寸;FTIR測試采用Bruker V80傅里葉紅外儀完成，掃描范圍400～4000 cm－1;采用美國Lake shore 7410型振動樣品磁強計進行樣品磁滯回線(M－H)測試.

采用考馬斯亮藍染色法在595 nm下測定蛋白質(zhì)的含量，通過標準工作曲線的繪制衡量漆酶在載體上的固載量［20］;以ABTS為漆酶底物，采用PerkinElmer Lambda 45 UV/Vis分光光度計在420 nm下測定漆酶活力.以每分鐘氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)［21］.固定化漆酶酶活回收率R(%)的計算公式為

式中，Ai是固定化酶的酶活(U)，Af是與固定化酶等量的游離酶的酶活(U).

圖1 載體和固定化漆酶的TEM照片

圖2 樣品的紅外譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化漆酶的結(jié)構(gòu)表征

圖1為Fe3O4/SiO2載體和固定化漆酶E－Fe3O4/SiO2－NH2－GA的 TEM 照片.圖1a顯示Fe3O4/SiO2載體具有明顯的“核 －殼”結(jié)構(gòu)，而且分散狀態(tài)較好，與文獻［19］報道的結(jié)果相一致;在圖1b中，載體聚集的程度明顯增加，這可能是負載漆酶的結(jié)果.進一步對樣品進行FTIR測試，結(jié)果如圖 2所示.在曲線 a上，580 cm－1處的振動峰歸屬于Fe3O4粒子的特征Fe － O 振動［22－25］，1630 cm－1和 3400 cm－1處的振動峰分別對應于O－H的彎曲振動和伸縮振動［22－23］;在曲線 b上，除了 Fe － O 振動之外，在461 cm－1、1080 cm－1處還新出現(xiàn)了 Si－O －Si的彎曲振動和反對稱伸縮振動［19，22］，960 cm－1處出現(xiàn)了Si－OH的對稱伸縮振動，說明載體Fe3O4/SiO2已經(jīng)形成;相比于曲線 b，曲線 c上位于2850 cm－1和 2930 cm－1處的對稱和反對稱的C—H伸 縮 振 動 峰［13，22］明 顯 增 強，而 且 在1465 cm－1處出現(xiàn)了一個小的 N—H 振動峰［14］，這是由于氨基修飾劑 APS上存在—C2H5和—NH2基團，這一結(jié)果表明氨基在Fe3O4/SiO2載體表面的成功修飾;進行戊二醛活化后，曲線d上 N －H 彎曲振動峰和2850 cm－1、2930 cm－1處的C—H鍵振動峰明顯減弱，同時可見1740 cm－1處游離的 H － C=O 振動峰［26］，說明—NH2與部分 H—C=O發(fā)生作用，由于—C=N—振動(1647cm－1)［14］與 O—H 振動位于同一范圍，因此無法嚴格區(qū)分;相對于曲線d，曲線e(固定化漆酶后)上1740 cm－1處的游離H—C=O振動峰基本消失，而—C=N—振動峰的強度和2850 cm－1、2930 cm－1處的 C—H 振動峰同時增強，前者是漆酶上的—NH2與戊二醛中—CHO作用的結(jié)果，后者是由于漆酶中含有C—H鍵，由此說明漆酶已經(jīng)在載體表面成功固載.

圖3 Fe3O4納米粒子的磁滯回線

圖3是Fe3O4納米粒子室溫時測得的磁滯回線，曲線的剩磁和矯頑力均趨于零，說明具有超順磁性［23］，這有利于固定化漆酶在液相體系中的分散.對 M －1/H 作圖，并外推至1/H=0［27］，得到載體的飽和磁化強度(Ms).外推結(jié)果顯示Fe3O4納米粒子的Ms分別為58.3 emu/g，表明，F(xiàn)e3O4納米粒子具有很好的磁響應性能，有利于固載漆酶后的分離.

圖4為固定化漆酶、Fe3O4/SiO2載體、游離漆酶的紫外－可見吸收光譜圖，從圖可見，游離漆酶的最大吸收峰在275～280 nm之間，因為蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵在275～280 nm處有吸收高峰，載體固定漆酶之后，在275 nm處出現(xiàn)明顯的吸收峰，進一步證明漆酶已經(jīng)鍵合到Fe3O4/SiO2的載體上.

圖4 樣品的紫外可見吸收光譜

2.2 漆酶固定化條件的研究

2.2.1 給酶量對漆酶固載量的影響

由圖5可見，漆酶的固載量隨著給酶量的增加而增加，當漆酶濃度達到0.6 mg/mL時，固載量達到最大值83.4 mg/g，濃度繼續(xù)增大，固載量不變.可見，100 mg磁性載體的最大固載量為8.34 mg .

圖5 給酶量對漆酶固載量的影響

2.2.2 固定化時間對漆酶固載量的影響

考察不同反應時間對漆酶固載量的影響，保證漆酶和磁性載體充分鍵合，如圖6，當固載時間為12 h時漆酶的固載量最大，繼續(xù)延長時間，固載量不再增加，確定漆酶與載體的最佳反應時間是12 h.

圖6 固定化時間對漆酶固載量的影響

2.3 固定化漆酶酶學性質(zhì)的考察

2.3.1 最適pH的考察

在20℃考察了固定化漆酶和游離漆酶的最適pH，結(jié)果如圖7所示.固定化漆酶和游離漆酶都是在pH=5時的酶活相對較高，因此最適pH都為5，即漆酶在固定化之后其最適pH沒有改變，而且當pH在3.0～4.0之間時，固定化漆酶的酶活高于游離漆酶，說明固定化漆酶對pH的穩(wěn)定性較游離漆酶好.

2.3.2 固定化漆酶反應的最適溫度

在不同溫度下分別對游離酶和固定化酶活力進行測定.如圖8，10～30℃之間，固定化漆酶和游離漆酶的反應活性很高，隨著溫度的繼續(xù)增加，酶活逐漸下降，相對游離漆酶，固定化漆酶的酶活下降較慢.溫度達到70℃時，固定化酶的活性保持在42%，游離酶的活性只剩27%，這表明固定化漆酶具有較好的溫度適應性.

圖7 pH對游離漆酶及固定化漆酶酶活的影響

圖8 溫度對游離漆酶和固定化漆酶酶活的影響

2.3.3 固定化漆酶操作穩(wěn)定性的考察

圖9是以ABTS為底物，考察的固定化漆酶重復使用10次的反應結(jié)果.數(shù)據(jù)顯示，固定化漆酶在重復使用10次后，酶活仍能保持在初始酶活的85%以上，即固定化漆酶的活力相對穩(wěn)定，說明漆酶與載體Fe3O4/SiO2鍵合穩(wěn)定，具有很好的操作穩(wěn)定性.

圖9 固定化漆酶的操作穩(wěn)定性

3 結(jié)論

通過改進Fe3O4/SiO2載體表面的氨基修飾條件，進行漆酶的固定化，考察漆酶的固定化條件和相應的酶學性質(zhì).FTIR數(shù)據(jù)表明，在室溫、乙醇/水為溶劑的較溫和條件下，氨基成功修飾了Fe3O4/SiO2載體表面，進而完成了漆酶在該載體表面的固定化.酶學性質(zhì)測試和磁性測試結(jié)果表明，漆酶在Fe3O4/SiO2載體表面固定化之后，最適pH和溫度變化不大，但操作穩(wěn)定性和分離性能得到了明顯改善.固定化漆酶在外加磁場的作用下可以與反應體系快速分離.以ABTS為底物，考察固定化漆酶的重復使用性能，發(fā)現(xiàn)漆酶在連續(xù)使用10次后，酶活仍能保持在初始酶活的85%以上，說明固定化漆酶有很好的操作穩(wěn)定性，利于漆酶的重復使用.

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Research on Immobilization of Laccase on Fe3O4/SiO2Support and its Properties

Xu Lulu，Wei Dongxue，Wang Hongxia
(Harbin Normal University)

The immobilization of laccase from Trametes Versicolor on magnetic Fe3O4/SiO2support by crosslinking method under mild conditions is investigated.TEM，F(xiàn)TIR，UV－vis and VSM measurements are used to characterize the immobilized laccase.The results show that the immobilization of laccase has little effect on optimum pH and temperture，while thermal stability，operation stability and separation are improved greatly.Using ABTS as substrate，the immobilized laccase is tested and separated under an external magnetic field，after 10 cycles of repeated use，the activities of enzyme still maintaine above 85%of the intial activity.

Laccase;Immobilization;Fe3O4/SiO2

2011－05－14

(責任編輯:李佳云)