不可分型流感嗜血桿菌外膜蛋白 P6基因真核質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

何多姣,劉雪晴,李雙霞,賈天軍,張玉妥

(河北北方學(xué)院病原生物與免疫學(xué)研究所,河北張家口 075000)

不可分型流感嗜血桿菌 (nontypeableHaem ophilus influenzae,NTHi)是一種在人群中攜帶率很高的病原菌,該菌能夠誘發(fā)炎癥而產(chǎn)生多種疾病,如急性中耳炎、鼻竇炎、結(jié)膜炎和慢性支氣管炎的反復(fù)發(fā)作及惡化[1]等,尤其是以其引起的急性中耳炎最為多見和嚴(yán)重,約 75%的兒童在 3歲之前至少患 1次中耳炎[2],NTHi一直是引起嬰幼兒和兒童中耳炎的主要病原菌,約占所有報(bào)道中耳炎的 20%～40%;加之 NTHi缺乏快速準(zhǔn)確的檢測方法[3],而且其對(duì)以氨芐西林為首的β-內(nèi)酰胺類等多種抗生素耐藥性不斷增強(qiáng)[4],使得臨床治療NTHi感染極為困難,因此目前亟待研究一種新型安全有效的疫苗來預(yù)防 NTHi的感染。研究證明在所有 Hi菌株 (含莢膜株及非莢膜株即 NTHi)中高度保守的外膜蛋白 P6(outermembrane protein P6,P6)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的體液免疫和細(xì)胞免疫,但是 P6蛋白的獲得極為繁瑣且量少。近年來核酸免疫的發(fā)展為我們研制疫苗提供了新的思路,本研究就是通過克隆NTHi-P6基因,構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/His A-P6,為 NTHi核酸疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞株

菌株 ATCC29247NTHi、感受態(tài)細(xì)菌 (E.coli,XL1-blue)、pcDNA3.1/His A質(zhì)粒、HeLa細(xì)胞株均為本室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶 B amHⅠ (50 U·μl-1)、N otⅠ(10 U·μl-1)、T4 DNA Ligase為 Takara公司產(chǎn)品;質(zhì)粒大量提取試劑盒、脂質(zhì)體、DNA Ladder DL10,000為碧云天公司產(chǎn)品;DNA Ladder DL22,000、Taq DNA聚合酶為凱基生物公司產(chǎn)品;FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG單克隆抗體、質(zhì)粒 mini提取試劑盒為 OMEGA B IO-TEK公司產(chǎn)品;鼠抗 NTHi-P6多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 P6目的基因的獲得

根據(jù) GenBank提供的 86-028NP株 Hi-P6基因序列應(yīng)用 Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì) P6特異性引物,上游引物序列為 5′CGGGGATCCATCATGATG AACAAATTTG 3′,其中單下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點(diǎn),雙下劃線部分為 Kozak序列(促進(jìn)質(zhì)粒真核內(nèi)表達(dá));下游引物序列為 5′ACGCGGCCGCCTATT AGTACGCT AACACT 3′,其中下劃線部分為NoⅠt酶切位點(diǎn),引物由金思瑞科技公司合成。通過 PCR擴(kuò)增獲得 P6基因,取液體腦心浸潤液肉湯中培養(yǎng) 18 h的 NTHi菌液 10μl,加入 90μl滅菌三蒸水,100℃煮沸 10 min,瞬時(shí)離心取上清作為模板 DNA。擴(kuò)增體系為 100μl:10μl 10×PCR Buffer,2μl dNTPs(10 mmo·lL-1),1.5μ上l游引物 (20μmol·L-1),1.5μl下游引物 (20μmol·L-1),1μl Taq聚合酶 (5 U·μl-1),84μl模板 DNA;反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性1 min,56℃退火 1 min,72℃引伸2 min,35個(gè)循環(huán);72℃充分延伸 10 min,4℃保存 PCR產(chǎn)物,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖電泳鑒定其結(jié)果。

1.4 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/His A-P6的構(gòu)建

B amHⅠ和 NotⅠ同時(shí)對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及真核載體 pcDNA3.1/HisA進(jìn)行雙酶切,酚-氯仿法純化產(chǎn)物。將純化的目的基因 P6與 pcDNA3.1/His A載體在 T4 DNA Ligase作用下進(jìn)行連接,連接體系為 20μl∶1.0μl T4 DNA Ligase,2.0μl 10 ×T4 Buffer,3.0μl P6(12 ng·μl-1),0.5μl pcDNA 3.1/His A (12 ng·μl-1),13.5μl滅菌三蒸水;反應(yīng)混合物置16℃12～16 h。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌 (E.coli,XL1-blue)接種至 LB固體 (氨芐抗性)培養(yǎng)基,37℃過夜。挑取培養(yǎng)基上單個(gè)菌落的一半制作模板,用目的基因 P6的特異性引物行 PCR法初步篩選陽性克隆,瓊脂糖電泳驗(yàn)證目的基因正確后將余下的半個(gè)菌落接種至液體LB(氨芐抗性)培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng) 18 h后取陽性克隆的培養(yǎng)物用試劑盒小量提取重組質(zhì)粒。

1.5 真核重組質(zhì)粒的鑒定

1.5.1 PCR鑒定 取部分重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/His AP6用目的基因 P6的特異性引物行 PCR法擴(kuò)增,而后行 1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5.2 酶切鑒定 取部分重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/His AP6與空質(zhì)粒 pcDNA3.1/HisA分別進(jìn)行雙酶切 (B amHⅠ、NotⅠ)后行 1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切是否能夠切出目的基因條帶。

1.5.3 測序鑒定 為進(jìn)一步從序列的準(zhǔn)確性上得到驗(yàn)證,另取部分重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序,以質(zhì)粒 pcDNA3.1通用引物 T7作為測序引物,并將測序結(jié)果與 GenBank中 P6基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞 HeLa中的表達(dá)

將 5×105個(gè) HeLa細(xì)胞接種于放置蓋片的 6孔板內(nèi),37℃、體積分?jǐn)?shù)為 0.05的 CO2中培養(yǎng) 24 h,在細(xì)胞生長達(dá) 60%～80%時(shí),取 2μg重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/HisA-P6、4μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,同時(shí)將轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 pcDNA3.1/His A的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后,取出 6孔板用預(yù)冷的 PBS洗滌 3次,丙酮固定10 min;PBS再次清洗 3次,10%胎牛血清室溫輕搖封閉 1 h,棄封閉液,每孔加入 30μl稀釋好的鼠抗 NTHi-P6多克隆抗體,4℃孵育過夜;次日,取出 6孔板 PBS清洗 3次,每孔加入 30μl稀釋好的 FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG單克隆抗體 (內(nèi)含 2μl Hoechst),室溫避光反應(yīng)1 h,PBS清洗 3次,60%甘油封片,立即于熒光顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增 P6基因

以 NTHi全基因組為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,近 500 bp附近可見一條帶 (圖1)。

圖1 NTHi-P6基因的 PCR擴(kuò)增1.Negative control(ddH2O);2.NTHi-P6 gene PCR product;3.DNA LadderDL10,000Fig 1 NTHi-P6 Gene PCR amplification

2.2 pcDNA3.1/HisA-P6重組質(zhì)粒 PCR、酶切鑒定

將重組質(zhì)粒行 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒一起分別進(jìn)行雙酶切 (B amHⅠ、NotⅠ)后產(chǎn)物行 1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果見圖2。PCR可見目的基因片段;重組質(zhì)粒雙酶切后可見兩個(gè)條帶:大片段與載體 pcDNA3.1/HisA大小 (5 514 bp)一致,小片段與目的基因大小 (462 bp)一致,而空質(zhì)粒中無目的條帶。上述結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 測序鑒定

將重組質(zhì)粒以 T7為引物進(jìn)行序列分析,并采用電腦DNA分析輔助軟件對(duì)所測定的DNA序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),插入的基因片段為 462 bp,結(jié)果顯示有 5個(gè)堿基突變,分別為第 54(A→G)位、66(A→C)位、114(T→A)位、153(T→A)位及 159(C→T)位 ,但這些突變子均位于密碼子第 3位屬于無效突變,不影響蛋白質(zhì)的正確表達(dá)。

圖2 重組質(zhì)粒 PCR、酶切鑒定結(jié)果1.DNA LadderDL22,000;2.pcDNA3.1/His A-P6 digested with BamHⅠ andNotⅠ;3.pcDNA3.1/HisA digested withBamHⅠandNotⅠ;4.Recombinant plas mids PCR productFig 2 The identification of recombinant plas m id by PCR restrictive,endonuclease enzyme

2.4 綠色熒光蛋白法檢測重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染 48 h后,間接免疫熒光法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pcDNA3.1/His A-P6的細(xì)胞胞漿內(nèi)有綠色熒光,而對(duì)照組無綠色熒光 (圖3),提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)NTHi-P6-His A融合蛋白。

圖3 NTHi-P6基因表達(dá)產(chǎn)物鑒定1.pcDNA3.1/His A-P6 recombinant plasmids group;2.pcDNA3.1/HisA plasmids groupFig 3 Indirect i mmunofluorescence assay results of NTHi-P6 expression

3 討 論

流感嗜血桿菌 (Haem ophilus influenzae,Hi)是一種定居于人體鼻咽部的機(jī)會(huì)性致病菌,約 2/3的健康兒童和 1/3的健康成人咽部都存在該病原菌,其易感人群主要是免疫力低下的兒童及老人。Hi可分為莢膜株及無莢膜株即NTHi;其中莢膜類的 b型流感嗜血桿菌 (Hib)曾是引起 5歲以下兒童侵襲性細(xì)菌感染的主要致病菌之一,它會(huì)導(dǎo)致腦膜炎、肺炎、會(huì)厭炎等疾病[5],但在 19世紀(jì) 70年代 Hib莢膜多糖疫苗應(yīng)用之后,無莢膜的 NTHi成為主要的致病菌,該菌引起的中耳炎、新生兒膿毒血癥、慢性支氣管炎的反復(fù)發(fā)作及惡化已經(jīng)成為各個(gè)國家較為嚴(yán)重的健康問題,隨著其耐藥性的增高,研制一種新型疫苗已顯得尤為重要。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì) NTHi的多種菌體抗原都有研究 ,如外膜蛋白 P6/P5/P2/P26、Haps蛋白[6]、HMW蛋白[7]等,但綜合各種文獻(xiàn),人們對(duì) P6蛋白的研究較為透徹,P6基因序列高度保守[8],存在于所有 Hi菌株上。P6核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列在 Hi菌株間的保守性分別為 97%、100%[9];而且 P6蛋白的抗原性極強(qiáng),在動(dòng)物模型中,它能夠激發(fā)動(dòng)物體內(nèi)的體液免疫及細(xì)胞免疫并產(chǎn)生保護(hù)性作用[10],在嬰幼兒中,血清中具有殺菌活性的 P6 IgG抗體水平與其患中耳炎的機(jī)會(huì)成反比[11-12],并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,P6作為研制NTHi疫苗的首選目標(biāo)是非常有前景的。

P6蛋白含量僅占 NTHi所有外膜蛋白的 1%～5%,其提取純化也較復(fù)雜,為此本研究著重探討 NTHi編碼基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),作者以 HeLa細(xì)胞和pcDNA3.1/HisA為載體,構(gòu)建以 NTHi-P6蛋白編碼基因?yàn)槟康幕虻恼婧吮磉_(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1/HisA-P6,并將真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞,探討其在 HeLa細(xì)胞中表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)表明:通過酶切鑒定和測序分析,pcDNA 3.1/HisA-P6構(gòu)建成功,同時(shí)轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察,pcDNA3.1/HisA-P6轉(zhuǎn)染組可見到綠色熒光,說明重組質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)融合蛋白,上述結(jié)果為DNA疫苗的研制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。我們將在以后實(shí)驗(yàn)中,以上述重組質(zhì)粒免疫小鼠,與 P6蛋白質(zhì)亞單位疫苗一起研究其免疫效果,為NTHi疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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