噬菌體展示隨機(jī)肽克隆的一種快速、高通量測(cè)序技術(shù)

楊芳,張文紅

(1.安康學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)院,陜西安康 725000;2.第四軍醫(yī)大學(xué)基因診斷技術(shù)應(yīng)用研究所,陜西西安 710032)

隨機(jī)肽庫(kù)主要包括噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)、大腸桿菌展示隨機(jī)肽庫(kù)和核糖體展示隨機(jī)肽庫(kù)三大類,它們?cè)诳乖砦环治觥⑸锎蠓肿酉嗷プ饔梦稽c(diǎn)分析、小分子肽疫苗設(shè)計(jì)及先導(dǎo)化合物的篩選等研究工作中已得到廣泛應(yīng)用。隨機(jī)肽庫(kù)淘篩一般會(huì)篩到大量的克隆,但要得到有意義的隨機(jī)肽序列則必須進(jìn)行大量的測(cè)序工作。使用常規(guī)DNA測(cè)序技術(shù)過(guò)程較為繁雜,費(fèi)用也比較高。本研究基于焦磷酸微測(cè)序 (Pyrosequencing)技術(shù),建立一種針對(duì)噬菌體展示隨機(jī)肽的高通量序列測(cè)定方案。

1 材料與方法

1.1 材料

環(huán) 7肽噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)試劑盒 (Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit)購(gòu)自美國(guó) New England Biolabs公司,PSQ96序列分析系統(tǒng)、Pyrosequencing試劑盒 (SQA Reagent Kit)購(gòu)自瑞典 Pyrosequencing AB公司。多肽區(qū)上游 PCR引物為 5′-attattattcgcaattcctttagt-3′,下游 PCR引物為 5′-ccacagacagccctcatagtt-3′(5′末端標(biāo)記生物素);微測(cè)序引物為 5′-acctttctattctcactctgctt-3′。

1.2 方法

1.2.1 環(huán) 7肽噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)的淘篩 以鏈親合素為篩選配基、生物素為洗脫液篩選鏈親合素的結(jié)合肽基序。每一輪淘篩的肽庫(kù)用量為 2×1011個(gè)噬菌粒,淘篩富集及擴(kuò)增過(guò)程按照肽庫(kù)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,共淘篩 3輪。

1.2.2 微測(cè)序模板的制備 第 3輪淘篩的噬菌體洗脫液,滴度測(cè)定后從 LB/IPTG/X-gal板上隨機(jī)挑選10個(gè)藍(lán)色噬菌斑作為模板,PCR擴(kuò)增隨機(jī) 7肽區(qū)序列:50μl反應(yīng)體系中 10×PCR反應(yīng)緩沖液5μl、25 mmol·L-1MgCl23μl、dNTPs的終濃度為125μmol·L-1、PCR引物的終濃度為 0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶 2.5 U。PCR反應(yīng)采用熱啟動(dòng),反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 min;然后 94℃變性 30 s,50℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共進(jìn)行 45個(gè)循環(huán);72℃延伸 5 min。隨機(jī)選 5例 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,取 5μl在 1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析。分別取 45μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移于 PSQ96微孔板中,加入 100μg鏈親合素包被磁珠和 45μl結(jié)合緩沖液 (10 mmol·L-1Tris-HCl,2 mol·L-1NaCl,1 mmol·L-1EDTA,0.1%Tween20,pH 7.6),65℃溫育15 min,固定 PCR產(chǎn)物。然后在0.5 mol·L-1NaOH中使 PCR產(chǎn)物解離為單鏈,用PSQ96樣品制備工具分離單鏈DNA。

1.2.3 Pyrosequencing測(cè)序 用 40μl退火緩沖液(20 mmol·L-1Tris-Acetat,2 mmol·L-1MgAc2,pH 7.6)懸浮單鏈 DNA模板并轉(zhuǎn)移于 PSQ96 Plate Low板中,向模板中各加入 5μl 3μmol·L-1的測(cè)序引物,80℃加熱 2 min,冷卻至室溫,將適量的酶混合物、底物混合物、dATPαS、dTTP、dCTP和 dGTP分別加于試劑艙中,并將 PSQ96 Plate Low板置于 PSQ96序列分析儀中進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序分析時(shí)的堿基分配順序?yàn)镚CAT,共進(jìn)行 24個(gè)循環(huán),其他參數(shù)采用 Pyrosequencing的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。

2 結(jié) 果

第 3輪淘篩的噬菌體洗脫液滴度為 2×107pfu·ml-1。噬菌體隨機(jī)肽克隆 PCR擴(kuò)增后,均得到 205 bp大小的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,無(wú)非特異產(chǎn)物 (圖1),滿足下一步的測(cè)序需要。應(yīng)用 Pyrosequencing技術(shù)對(duì) 10例樣品的隨機(jī) 7肽區(qū)進(jìn)行序列分析,得到一個(gè)GXXXHPQ的同源基序 (X為任意氨基酸),此基序?yàn)殒溣H合素的結(jié)合肽基序,結(jié)果與預(yù)期相符合。

圖1 噬菌體隨機(jī)肽克隆的 PCR擴(kuò)增Fig 1 Amply random peptide fragment by polymerase cha i n reaction

3 討 論

Pyrosequencing技術(shù)是一種短序列的微測(cè)序技術(shù)。測(cè)序反應(yīng)所需的待檢測(cè)基因模板為單鏈 DNA,其制備原理為:對(duì)應(yīng)于待測(cè)單鏈的 PCR引物標(biāo)記生物素,PCR產(chǎn)物和生物素的配體——鏈親合素包被的磁珠混合,同時(shí)在變性液中使雙鏈 DNA解離為單鏈,再在磁場(chǎng)中純化得到標(biāo)記有生物素的單鏈待測(cè)模板。單鏈待測(cè)模板和測(cè)序引物退火結(jié)合,隨后逐一加入 4種dNTP進(jìn)行引物的延伸反應(yīng)。當(dāng) dNTP摻入時(shí)將釋放焦磷酸基團(tuán) (PPi)。ATP硫酸化酶在 APS底物的存在下可以催化焦磷酸形成 ATP,ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化,同時(shí)釋放出可見(jiàn)光信號(hào)。光信號(hào)由冷 CCD攝像機(jī)檢測(cè),強(qiáng)度經(jīng)軟件分析后反應(yīng)為一個(gè)峰高。由于酶級(jí)連反應(yīng)的每一步均與上一步存在量的正比依賴關(guān)系,每個(gè)光信號(hào)的峰高將與反應(yīng)中摻入的 dNTP量成正比。ATP和未摻入的 dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解,淬滅光信號(hào)并再生反應(yīng)體系,完成一個(gè)循環(huán) (若加入的 dNTP不能配對(duì)摻入則再生反應(yīng),加入下一種 dNTP,直至有堿基摻入)。以上步驟循環(huán)進(jìn)行中DNA鏈不斷延伸合成,從信號(hào)峰的順序及強(qiáng)度可以讀出所檢測(cè)的序列[1-2]。

運(yùn)用 Pyrosequencing技術(shù)進(jìn)行微序列測(cè)序具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)操作簡(jiǎn)易快速,測(cè)序過(guò)程可以實(shí)時(shí)檢測(cè),不需等候;(2)高通量,采用 96孔板,1 h即可完成 96個(gè)樣品的測(cè)序;(3)與常規(guī)方法相比測(cè)序成本低,可以大大降低研究費(fèi)用。此外,噬菌體展示隨機(jī)肽測(cè)序時(shí)無(wú)需培養(yǎng)、制備單鏈?zhǔn)删w,可以使操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化。Pyrosequencing技術(shù)可以準(zhǔn)確讀取的序列長(zhǎng)度在 30 bp以上,如果進(jìn)一步優(yōu)化條件,甚至可以準(zhǔn)確讀取 200 bp的序列[3]。常見(jiàn)隨機(jī)肽庫(kù)主要有隨機(jī) 7肽庫(kù)、隨機(jī) 9肽庫(kù)和隨機(jī) 15肽庫(kù)等,其 DNA序列長(zhǎng)度在 20 bp到50 bp之間,因而,此技術(shù)必定可以廣泛應(yīng)用于各種隨機(jī)肽庫(kù)的篩選測(cè)序。

[1]RONAGH IM,KARAMOHAMED S,PETTERSSON B,et al.Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release[J].AnalyticalBiochemistry,1996,242(1):84-89.

[2]RONAGH IM,UHLEN M,NYREN P.A sequencing method based on real-ti me pyrophosphate[J].Science,1998,281(5375):363-365.

[3]RONAGH IM.Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing[J].Genome Research,2001,11(1):3-11.